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细胞生物学Cell Biology

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各类western转膜条件

丁香园上一篇好文章!

除了抗体原因,转膜恐怕是western blot成败的最关键因素。 


蛋白来源:RAW264.7 总蛋白

蛋白名称(可保密):一些转录因子
蛋白分子量:40~70 KD
WB用膜类型、孔径:0.45 NC
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒流400 mA
转膜时间:60~90 min
PS.其实吧,以我的经验来看,除非目的蛋白特别小,或者特别大,不然转膜时间真的不是那么重要, 曾经因为失误,转了15 min就拆下来了,但从丽春红染色来看,跟平常实验也没有太大的区别。

蛋白来源:内皮细胞 总蛋白
蛋白名称(可保密):occludin & AKT
蛋白分子量:65 KD & 56 KD
WB用膜类型、孔径:0.45 PVDF
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒压 100 V
转膜时间:60~70 min
设备名字是“Bio-Rad mini”。

蛋白来源:乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织 总蛋白和核蛋白
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:65 KD & 55 KD
WB用膜类型、孔径:PVDF(预先用甲醇处理)
转膜方式(恒压、恒流):半干转 恒压 12 V
转膜时间:30-40 min
设备:“Bio-Rad mini”
建议:最开始做过湿转(过夜的那种),太费事费时,效果也不如半干转。

蛋白来源:293T细胞
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:95 KD & 35 KD
WB用膜类型、孔径:PVDF
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒压 90 V-110 V,控制电流不要超过300 mA。
转膜时间:70 min

蛋白来源:肿瘤手术标本
蛋白名称(可保密):转录因子
蛋白分子量:33 KDa
WB用膜类型、孔径:PVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):350 mA 恒流
转膜时间:150 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad
说明:相同条件曾用于数个30-70 KDa的蛋白,都能成功转上,不过没有试缩短时间效果如何; 实验时没为转膜条件苦恼,倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。

蛋白来源:成纤维细胞
蛋白名称(可保密):smad3
蛋白分子量:54 KDa
WB用膜类型、孔径:PVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):350 mA 恒流
转膜时间:150 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad

蛋白来源:胰腺癌细胞
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:16 KDa and 42 KDa
WB用膜类型、孔径:PVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):120 V 恒压
转膜时间:90 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad


蛋白来源:大鼠血管平滑肌细胞
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:72 KD,42 KD 和22 KD
WB用膜类型、孔径:一般的PVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):湿转,恒流一张膜0.26 A,两张膜0.3 A。
转膜时间:90 min
设备:“Bio-Rad mini”
建议:转膜缓冲液最多用3次,最好现用现配,我们用的没有加SDS,转的时候最好能用冰块一类的东西降一下温,这样转的效果要好一些,转的时候一定要把三明治每层之间的气泡除去,同时使滤纸大于膜,膜大于胶,以免烧坏电极。

蛋白来源:大鼠PBMC
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:55 KD
WB用膜类型、孔径:0.22的PVDF膜
转膜方式(恒流):湿转
转膜时间:60-90 min
设备:“Bio-Rad mini”
建议:转膜液用过两三次之后转膜效果就很差了 其它按照常规就好了  其实0.22的膜一般不怕转过头 以我们的经验,转膜时间、电压其实 也有很大范围的调整 ,并不是非要固定于哪一个最合适,曾经做过  一张膜转,17 KD的和170 KD的,按照170 KD的条件,17 KD的转膜也很好的。

蛋白来源:人非小细胞肺癌细胞系
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:大于250 kD
WB用膜类型、孔径:millipore PVDF膜 0.45 um
转膜方式(恒压、恒流):湿转,恒流0.3A。
转膜时间:180min
设备:“Bio-Rad ”
建议:电转保持电压在70 V以上,保持低温,如果电压低过70就需要换缓冲液了。


蛋白来源:白血病细胞
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:28 KD
WB用膜类型、孔径:0.45的NC膜
转膜方式(恒流):湿转,90 min,0.25 A
设备:“Bio-Rad ”
建议:海绵厚度要合适,一次转磨用的海绵太薄,导致三明治没夹紧,转膜后拿出来一看,marker都变得七扭八歪。但是有前辈说垫的海绵太厚可能将胶压断,没经历过,不知道是不是会有这种情况。

蛋白来源:肿瘤细胞
蛋白名称(可保密):磷酸化蛋白
蛋白分子量:10-200 KDa
WB用膜类型、孔径:millipore PVDF膜 0.45 um
转膜方式(恒压、恒流):120 v 恒压
转膜时间:120 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad
建议:转膜缓冲液只用2次,基本都转上,5%BSA封闭,减少背景。
 
蛋白来源:胰腺β细胞
蛋白名称(可保密):******
蛋白分子量:90-130 KDa
WB用膜类型、孔径:PVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):250 mA 恒流
转膜时间:150 min
转膜设备:湿转
 
蛋白来源:原核表达
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:38 KD
WB用膜类型、孔径:0.45 NC
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒压:100 V
转膜时间:120 min
 
蛋白来源:心脏
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:220 kDa,130 kDa,70 kDa,41kDa
WB用膜类型、孔径:PVDF
转膜方式(恒压、恒流):恒压
转膜时间:70 v120 min,180 min,5-6 h
转膜设备:伯乐湿转
建议改进方向(可选):40 kDa一下,70 v ,60-90 min足够,40-70 kDa 90-120 min即可。
70-120 kDa ,70 v,120-180 min足够,120-180 kDa ,180-240 min,180 kDa以上建议6 h。
 
蛋白来源:卵巢癌细胞膜蛋白
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:53 KD
WB用膜类型、孔径:PVDF膜 0.45 um
转膜方式(恒压、恒流):恒压
转膜时间:80 V 100 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad
 
蛋白来源:人宫颈癌HELA细胞总蛋白
蛋白名称(可保密):β-actin
蛋白分子量:42
WB用膜类型、孔径:PVDF膜 0.45 um
转膜方式(恒压、恒流):恒压
转膜时间:50 4 h
转膜设备:湿转 Bio-Rad

 
蛋白来源:脑组织
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:16 KD、27 KD、32 KD、42 KD
WB用膜类型、孔径:PVDF 0.22 um
转膜方式(恒压、恒流):半干转 恒流 1 mA/cm2或2 mA/cm2
转膜时间:不定
转膜设备:北京六一仪器
建议:我共做了六个蛋白,所以总在想节约时间的方式。
在预试时我会观察电压数与转膜效率的关系,所以我不会按时间来定何时转完,而是按电压来定。通过染胶来确定电压数与转移蛋白分子量上限的关系。这样有的5分钟就转完了,不用多浪费时间。并且六一的半干转膜仪随着使用次数的增多,效率也会下降,所以时间和转膜效率(尤其是使用后期)的关系并不稳定,单纯依靠时间有时会有问题。
 
蛋白来源:CHO cell
蛋白名称(可保密):酶原
蛋白分子量:40 KD
WB用膜类型、孔径:0.22的PVDF膜(Biorad)
转膜方式(恒压):100 V,湿转,转膜时间:60 min。
设备:Tanon(上海天能)
建议:
1.  转膜液现用现配,用完倒掉。
2.  转膜时间,电压可以适当调整。分子量大或者小一些的蛋白,采用此条件一样转膜效率很高。
 
蛋白来源:Hepg2
蛋白名称(可保密):EGFR
蛋白分子量:170kd
WB用膜类型、孔径:pvdf 0.45
转膜方式(恒压、恒流):24V
转膜时间:2个半小时
转膜设备:伯乐半干转

 
蛋白来源:肝癌细胞
蛋白名称:HIF-1α
蛋白分子量:120 kD
WB用膜类型、孔径:NC膜
转膜方式(恒压):80伏,湿转
转膜时间:150分钟
设备:“Bio-Rad mini”
建议:湿转,转膜液特别重要,否则会导致电压或者电流不稳影响转膜条带。转膜均现配先用,不重复利用。转膜时间一般是150分钟,80伏恒压。经李春红染色,靠近蛋白胶的一侧膜上蛋白染色深,膜另外一面染色浅,说明蛋白未转过。该湿转条件自己做过的蛋白分子量范围:170-36 kD。
 
蛋白来源:心肌细胞总和膜
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:128 KD,100,60,55,43 KD
WB用膜类型、孔径:NC膜 0.2 um
转膜方式(恒压、恒流):恒压
转膜时间:70 V 200 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad

建议:转膜液最好现配现现用,或配成母液,最好不重复使用,70 V电压下,电流约154 mA。甲醇可以加到150 ml。对大分子量如200 KD转膜时间延长6-8 h。


蛋白来源:肺脏

蛋白名称(可保密):ICAM-1
蛋白分子量:85~110 KD
WB用膜类型、孔径:0.22NC
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒流 300 mA
转膜时间:120 min
设备名字 Bio-Rad mini
一抗用的santa cruz 1 mL包装的。 比例调整到1:800做出很好的条带。 效价会一直降低的。去年做的这个指标,今年夏天做就不行了。
 
蛋白来源:成纤维细胞
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:16 KDa
WB用膜类型、孔径:0.2 um PVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):0.2 A恒流
转膜时间:65 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad
 
蛋白来源:成纤维细胞
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:28 KDa
WB用膜类型、孔径:0.2 umPVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):0.25 A恒流
转膜时间:60 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad
 
蛋白来源:人肿瘤细胞
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:80 KD
WB用膜类型、孔径:0.45 um PVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):半干转移系统恒流,勿超过0.85 mA/cm2,同时转多张膜电流需累加(串联)
转膜时间:60-90 min
设备:Bio-Rad
其实有些东西并不是非常严格的,要转移的目的蛋白分子量小,那么转移的时间就短一些,反之,则长一点;蛋白量充足,可以多转一会,蛋白量较少,则要少转一下,免得蛋白穿膜而过到了滤纸上而前功尽弃。
 
蛋白来源:人和鼠肝癌细胞总蛋白、胞浆、胞核蛋白
蛋白名称(可保密):***
蛋白分子量:17--116 kd
WB用膜类型、孔径:PVDF膜 0.45 um
转膜方式(恒压、恒流):恒流 200 mA
转膜时间:3 h
转膜设备:湿转 北京六一 24D mini
 
蛋白来源:CO COS7 293T
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:80 72 56 52 48 25 18KD
WB用膜类型、孔径:0.45 um PVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):湿转 90 V 电流约为230--280 mA之间。两张膜串联叠加。
转膜时间:40 min
设备:Bio-Rad 法码西亚
 
蛋白来源:人肿瘤细胞
蛋白名称(可保密):磷酸化蛋白
蛋白分子量:30-60 KDa
WB用膜类型、孔径:pall NC膜 0.45 um
转膜方式(恒压、恒流):恒流 0.85-1 mA/平方厘米膜
转膜时间:60-90 min
转膜设备: 北京六一 半干转
建议:转膜缓冲液用新鲜配制的,可先配成2倍的母液,转膜液的多少会影响电转的效率,一般将吸水纸润湿即可,不要和膜一起浸泡,这样效果很好。
 
蛋白来源:人肝癌肿瘤细胞
蛋白名称(可保密):notch
蛋白分子量:60-120 KDa
WB用膜类型、孔径:pall NC膜 0.45 um
转膜方式(恒压、恒流):恒流 0.3 A
转膜时间:-20度冰柜120 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad
建议:转膜缓冲液用新鲜配制的,可先配成10倍或5倍的母液,保持低温是转膜效果的一个保证,这样效果很好。
 
蛋白来源:胶质瘤细胞总蛋白和核蛋白
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:18 KDa 、36 KDa、55 KDa、98 KDa
WB用膜类型、孔径:NC膜 PALL
转膜方式(恒压、恒流):0.35 恒流
转膜时间:60 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad mini
转缓液的配制有点讲究。如果蛋白大于一百多,一般加入SDS,时间延长结果会更好些。
由于,目前试验的蛋白就都不大,所以,我们都采用不加SDS的转缓液,跑出来的条带也很整齐、干净。
 
蛋白来源大肠癌205
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:92 kd,43 kd
WB用膜类型、孔径:0.45pvdf
转膜方式(恒压、恒流):恒压
转膜时间:90 min
转膜设备:湿转,天能。
 
蛋白来源:大鼠脑组织
蛋白名称(可保密):BDNF(28 KDa)、Bactin(42 KDa)、LaminB(72 KDa),以及磷酸化蛋白(保密 43 KDa)
WB用膜类型、孔径:PVDF(0.45)膜
转膜方式(恒压、恒流):300 mA 恒流
转膜时间:60 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad Mini
转膜缓冲液:25%甲醛 觉得这个浓度的甲醛可以有效降低电转的热量,而且使膜对蛋白的吸附效果较好,Marker转到膜上很鲜艳。 用立春红染色效果也很好。

 
蛋白来源:表达产物
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:29 KDa
WB用膜类型、孔径:PVDF
转膜方式(恒压、恒流):0.3 A 恒流
转膜时间:80 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad
 
蛋白来源:cell lysate, culture medium
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:15-50 kD
WB用膜类型、孔径:NC,PVDF, 0.45 um
转膜方式(恒压、恒流):恒压, semi-dry
转膜时间:about 2h is ok if the protein is small and the voltage can keep 100 V, if not increase to 3-4 h。
转膜设备: Bio-Rad
 
蛋白来源:肺脏、肝脏等。
蛋白名称(可保密):actin
蛋白分子量:43 kD
WB用膜类型、孔径:NC膜PALL 0.22 um
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒流 200 mA
转膜时间:45~60 min
设备名字 Bio-Rad mini
用的santa cruz 分装和整装的都可以。效价一般1:1000-1:3000左右,可稳定较长一段时间。
 
蛋白来源肺脏
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:19 kd,35 kd
WB用膜类型、孔径:0.2pvdf
转膜方式(恒压、恒流):恒流250
转膜时间:150 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad mini
 
蛋白来源:大鼠血管
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:140 kd
WB用膜类型、孔径:0.45pvdf
转膜方式(恒压、恒流):恒流,200 mA
转膜时间:210 min
转膜设备:湿转,北京六一
 
蛋白来源:心肌
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:90 kDa,70 kDa,12.6 kDa
WB用膜类型、孔径:NC
转膜方式(恒压、恒流):恒压
转膜时间:70 v 240 min,120 min,60 min
转膜设备:伯乐湿转

蛋白来源:脑
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:16 KD 60 KD
WB用膜类型、孔径:16的用0.22的PVDF,60的用0.45的NC
转膜方式(恒压、恒流):20 V
转膜时间:16的30 min,60的90 min
转膜设备:Bio-Rad 半干
 
蛋白来源:子宫内膜癌组织
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:156.8
WB用膜类型、孔径:NC膜
转膜方式(恒压、恒流):恒流400mA
转膜时间:90 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad
 
蛋白来源:真核表达
蛋白名称(可保密):(多种,30个以上)
蛋白分子量:40-200 kD
WB用膜类型、孔径:PVDF
转膜方式(恒压、恒流):恒压100 V(电流在280 mA至350 mA之间)
转膜时间:60 min(M<100kD),60-100min (100kD<M<200kD)
转膜设备:湿转
 
蛋白来源:大鼠肾脏
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:130 kD
WB用膜类型、孔径:0.45NC膜 PALL
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒流 350 mA
转膜时间:120min
设备名字 Bio-Rad mini
一抗用的sigma 羊抗大鼠,0.2 mL包装的,打折后价格3000多,有些贵哦。
比例调整到1:1500左右条带可,用BSA封闭。但是背景稍高。
 
蛋白来源:脑组织
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:38 KDa
WB用膜类型、孔径:PVDF膜,
转膜方式(恒压、恒流):80 v恒压
转膜时间:180 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad mini

 
蛋白来源:真核表达
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:约35 kD(双亚基)
WB用膜类型、孔径:0.22 um PVDF
转膜方式(恒压、恒流):恒流200 mA
转膜时间:60 min
转膜设备:湿转Bio-rad,天能,六一
转膜时间其实不需要那么长的,转膜没转上一般原因不在这里,可能是转膜液的原因:有些蛋白SDS可能影响其与膜的结合,还原型电泳因巯基乙醇的原因也可能导致后面的抗体不结合(这是我最近的经验教训),还有一抗的选择很重要,一定要选识别线性表位的抗体,才能用于做WB。
 
蛋白来源:细菌蛋白
蛋白名称(可保密):全部的可溶性蛋白
蛋白分子量:11-170 KD
WB用膜类型、孔径:0.45 NC
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒流300 mA
转膜时间:80 min
 
蛋白来源: 骨肉瘤细胞
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量: 72 kDa
WB用膜类型、孔径: PVDF膜(0.45 um)
转膜方式(恒压、恒流): 半干转 恒流200 mA
转膜时间: 20-30 min
转膜设备:Bio-Rad 型号忘了,就是有4个插孔的电泳仪。
建议改进方向:低温很重要,新鲜的电转液也很重要。


蛋白来源:骨肉瘤CELL LINE

蛋白名称(可保密):Beta actin
蛋白分子量:42 kDa
WB用膜类型、孔径:Nitrocellulose Membrane 0.2 um Pore Size (Invitrogen)
转膜方式(恒压、恒流):湿转,恒压22 v
转膜时间:90 min
转膜设备:X-cell Sure Lock Mini-cell (Invitrogen)
建议改进方向:转膜过程冰水浴,保持低温,Transfer Buffer重复使用。

 
蛋白来源:肾瘤细胞
蛋白分子量:39 kDa
WB用膜类型、孔径:Nitrocellulose Membrane 0.2 um Pore Size (Invitrogen)
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒压100 v
转膜时间:50 min
 
蛋白来源:MCF7
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:70 kDa
WB用膜类型、孔径:PVDF膜(GE)
转膜方式(恒压、恒流):湿转 100伏
转膜时间:60 min
转膜设备:伯乐小转膜仪
 
蛋白来源:pichia 分泌表达
蛋白名称(可保密):细胞因子等
蛋白分子量:17到30 kDa
WB用膜类型、孔径:millipore PVDF 0.45 um
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒压:100 V
转膜时间:60 min
这个条件除了100 KDa的预染maker转的不好,剩下的条带都非常清晰。正向前面ycwzq说的,感觉时间不是很重要,只要蛋白别太小或太大,在一个比较宽的时间和电压范围都能转上。当然这些还有一个重要的影响因素就是所用的蛋白转印缓冲液。
 
所以建议把自己用的转印缓冲液的配方也贴上,便于分析交流。
我先说我的吧,是大师兄师姐的配方,我用了感觉还不错,但是100 KDa以上的转的不好。
蛋白转印缓冲液pH8.2:Tris碱1.93 g,甘氨酸9 g,甲醇200 ml,加水定容至1000 ml。
 
蛋白来源: 大鼠坐骨神经
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量: 30 kDa
WB用膜类型、孔径: PVDF膜(0.2 um)
转膜方式(恒压、恒流): 湿转 恒流300 mA
转膜时间: 45 min
转膜设备: Bio-Rad
 
蛋白来源:小鼠胚胎成纤维
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:36 KDa、55 KDa
WB用膜类型、孔径:PVDF膜 0.45
转膜方式(恒压、恒流):0.3 A 恒流
转膜时间:60 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad mini
垫子变薄时,可用三层纤维垫,也没问题。
 
蛋白来源:小鼠前列腺癌细胞
蛋白名称(可保密):P53 P21 RAD51 GAPDH
蛋白分子量:53 KDa、21 KDa、37 KDa、36 KDa
WB用膜类型、孔径:PVDF膜 0.45
转膜方式(恒压、恒流):恒压110 v
转膜时间:60 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad mini
 
蛋白来源:HEK293总蛋白
蛋白名称(可保密):***
蛋白分子量:~200KD
WB用膜类型、孔径:PVDF膜 0.2 um (用甲醇预先处理)
转膜方式(恒压、恒流):恒压 25 V
转膜时间:过夜 (~16-20 hours)
转膜设备:biorad mini
 
蛋白来源:人前列腺癌细胞
蛋白名称(可保密):***
蛋白分子量:~40 KD
WB 用膜类型、孔径:PVDF膜 0.45 um (用甲醇预先处理)
转膜方式(恒压、恒流):恒压 20 V, 限制最高电流0.3 A。
转膜时间:过夜 (~16-20hours)
转膜设备:biorad semi-dry
 
蛋白来源:组织
蛋白名称(可保密)
蛋白分子量:42 KDa
WB用膜类型、孔径:PVDF膜(0.22)
转膜方式(恒压、恒流):350 mA 恒流
转膜时间:60-90 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad
 
蛋白来源:E.Coli BL21
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:4 kd
WB用膜类型、孔径:PVDF 0.22 um
转膜方式(恒压、恒流):恒压15 v
转膜时间:O/N
转膜设备: Bio-Rad Mini 湿转
转膜液的配制:for 1 L transfer buffer, 200 ml Methanol,14.4 g Glycine,3.03 g Trizma-base。
用了Trcine-gel SDS Page,效果不错
 
蛋白来源:肾脏
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:23 kd
WB用膜类型、孔径:PVDF 0.45 um
转膜方式(恒压、恒流):恒压20 v
转膜时间:35 mins
转膜设备: Bio-Rad 半干
 
蛋白来源: 来自MDCK增殖的流感病毒裂解物
蛋白名称(可保密):PB1
蛋白分子量: 96 kd (注意,10% SDS-PAGE,冰上电泳。用预染marker观察100kd的条带跑到胶的正中间位置时,才开始转膜,否则转膜效率降低)
WB用膜类型、孔径: NC膜, 0.45
转膜方式(恒压、恒流):恒压,100V
转膜时间: 2 hours
转膜设备: BIO-rad 转膜设备。其间,准备一个冰盒,将电泳槽半埋到冰里。
转膜液的配制:(如甲醇的比例和是否加SDS以及多大质量浓度等): 2.9 g甘氨酸,5.8 g tris,0.37 g SDS,200 ml甲醇。
 
蛋白来源:肾脏
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:9 kd
WB用膜类型、孔径:PVDF 0.22 um
转膜方式(恒压、恒流):恒压20 v
转膜时间:30 min
转膜设备: Bio-Rad 半干
 
蛋白来源: 软骨细胞
蛋白名称(可保密):b-actin
蛋白分子量: 43 kd
WB用膜类型、孔径: PVDF膜, 0.45
转膜方式(恒压、恒流):湿转,恒流,350 mA
转膜时间: 85 min
转膜设备: BIO-rad 转膜设备。其间,准备一个冰盒,将电泳槽半埋到冰里。
转膜液的配制:(2.92 g甘氨酸,5.8 g tris,0.375 g SDS,200 ml甲醇,用双蒸水定容到1 L)
 
蛋白来源:宫颈癌细胞
蛋白名称:保密
蛋白分子量:60 kD
WB用膜类型、孔径:PVDF膜 0.45 uM
转膜方式(恒压、恒流):恒流,按膜的面积来算电流,标准大小的膜-60 mA/张
(8.2 cm x 6.0 cm)
转膜时间:2 h
转膜设备:Biorad semi-dry
转膜液的配制:Boston Bioproduct Transfer buffer +10-20% 甲醇
建议改进方向:
做半干转的时候,三明治上面再压一张滤纸,可以保证压紧,转膜效率稳定。用这个条件做过不少不同分子量的蛋白,最小从15 kD,到最大235 kD,都可以得到稳定结果。转膜液只用一次,不重复使用。
 
蛋白来源:家牛肝细胞
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:30 kDa
WB用膜类型、孔径:NC, 6x8 cm, 0.45 um
转膜设备:Invitrogen 湿转,外层冰水浴冷却。
转膜方式(恒压、恒流):恒流170 mA
转膜时间:根据胶的厚度而定,每0.5 mm转30 min, 1.5 mm的超厚预制胶转1.5-2 h。
转膜液的配制:10 mM碳酸氢钠,3 mM碳酸钠,20%甲醇。
建议改进方向:已考染的胶脱色后可以用此法转膜,条带稍淡但不影响结果。

 
蛋白来源:组织
蛋白名称(可保密)
蛋白分子量:170 KDa
WB用膜类型、孔径:PVDF膜(0.45)
转膜方式(恒压、恒流):300 mA 恒流
转膜时间:170 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad
 
蛋白来源:HepG2细胞
蛋白名称(可保密):Akt及P-Akt
蛋白分子量:55KDa/56KD
WB用膜类型、孔径:PVDF膜 0.45孔径
转膜方式(恒压、恒流):100V 恒压
转膜时间:75 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad

 
蛋白来源:大鼠
蛋白名称(可保密):Bactin(42 KDa)
WB用膜类型、孔径:PVDF(0.45)膜
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒流150 mA
转膜时间:100 min
转膜设备: 北京六一
 
蛋白来源: 大鼠大脑皮质
蛋白名称(可保密):b-actin
蛋白分子量: 43 kd
WB用膜类型、孔径: PVDF膜, 0.45
转膜方式(恒压、恒流):半干转,恒流,2 mA/cm2
转膜时间: 8-55 min
转膜设备: BIO-rad 转膜设备。
转膜液的配制:(2.92 g甘氨酸,5.8 g tris,0.375 gSDS,200 ml甲醇,用双蒸水定容到1 L)

 

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