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细胞生物学Cell Biology

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细胞培养问答(三)
70、 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现,该如何处理?
血清中沉淀物的出现有许多种原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成,而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后,也会存在于血清中,亦是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物,并不影响血清本身的质量。
 
若欲去除这些絮状沉淀物,可以将血清分装至无菌离心管内,以400 g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物,因为它可能会阻塞过滤膜。
 
71、为什么要热灭活血清?
 
加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究,培养ES细胞、平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。
 
72、有必要做热灭活吗?
 
实验显示,经过正确处理的热灭活血清,对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察,像是“小黑点”,常常会让研究者误以为是血清遭受污染,而把血清放在37℃环境中,又会使此沉淀物更增多,使研究者误认为是微生物的分裂扩增。
 
若非必须,可以不需要做热处理这一步。不但节省时间,更确保血清的质量。
 
73、为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?
 
有些胎牛血清产品没有预老化,储存在2-8 ℃时,血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在-20 ℃储存胎牛血清,避免反复冻融。
 
74、如何避免沉淀物的产生?
 
我们建议您在使用血清的时候,注意下列的操作:
 
(1)解冻血清时,请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温),若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃),非常容易产生沉淀物。
 
(2)解冻血清时,请随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。
 
(3)请勿将血清置于37 ℃太久。若在37 ℃放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害,而影响血清的质量。
 
(4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以无须做此步骤。
 
(5)若必须做血清的热灭活,请遵守56 ℃,30分钟的原则,并且随时摇晃均匀。温度过高,时间过久或摇晃不均匀,都会造成沉淀物的增多。

75、 液体培养基的保存是冷藏好?还是冷冻好?
 
要冷藏!因为液体培养基经冷冻后再经溶化时,其溶液的pH值会发生改变,溶液往往变碱,某些成分溶解也会受到影响对细胞生长不利。故液体培养基一定要存放在冷藏箱中,通常液体培养基在冷藏条件下可存放6个月 ~ 一年。
 
76、 液体培养基中谷氨酰胺的作用,及使用方法。
 
几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求,细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡。所以,各种培养液中都含有较大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定,应置-20 ℃冰冻保存,用前加入培养基中。加有谷氨酰胺的液体培养基4 ℃冰箱储存两周以上时,应重新加入原来量的谷氨酰胺。基础医学细胞中心在其服务项目中配制分装了高浓度(100倍)的谷氨酰胺溶液(1 ml/支)。每支1 ml的谷氨酰胺加到99 ml完全培养基中,其终浓度为2 mM/ml培养基。包装为粉红色,-24 ℃保存。
 
77、培养用液pH对细胞生长的影响
 
由于,大多数细胞适宜pH为7.2~7.4,偏离此范围对细胞将产生有害的影响。各种细胞对pH的要求也不完全相同,原代培养细胞一般对pH变动耐受差,无限细胞系耐受力强。
 
但总体来说,细胞耐酸性比耐碱性强一些,偏酸环境中更利于细胞生长。因此,我们在配制培养用液时,可把液体的pH稍微调得偏酸一些。液体在经过0.10 um或0.22 um滤膜过滤时,溶液的pH还会向上浮动0.2左右。
 
78、常用培养基及培养用液的渗透压范围
 
培养基名称                渗透压范围(mOSM)
DMEM(高糖)              315 ~ 350
DMEM(低糖)              270 ~ 330
RPMI-1640                     260 ~ 290
MEM-EBSS                     280 ~ 310
MEM-NEAA                     280 ~ 310
McCoy5a                        280 ~ 310
MEM-a                             280 ~ 310
M-199                              275 ~ 305
IMDM                               270 ~ 300
DMEM/F-12                    280 ~ 310
F-10                                 270 ~ 300
F-12                                 275 ~ 300
培养基名称                 渗透压范围(mOSM)
L-15                                280 ~ 320
D-Hanks                        280 ~ 300
Hanks                            280 ~ 300
PBS                                275 ~ 300
 
79、细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好吗?
 
不见得!因为胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca++, Mg++离子和血清等因素有关。通常情况下,pH 8.0 ,温度 37 ℃其作用能力最强。另外,钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。我们每次进行传代消化前,一定要用D-Hanks液或PBS液反复冲洗细胞培养瓶,以便于将含血清的培养基冲洗干净,这样就能大大提高消化液的消化能力。本中心通常使用的消化液浓度为:
 
(1)0.05%胰蛋白酶+0.02% EDTA;
 
(2)0.25%胰蛋白酶+0.03% EDTA;

(3)0.25% 胰蛋白酶

 
溶液pH8.0-9.0;使用D-Hank液配制。
 
多数细胞传代消化可使用0.05%胰蛋白酶+0.02% EDTA这种消化液。

80、培养基在使用过程中应注意的问题
 
(1). 培养基在使用前需37 ℃预热或在室温平衡后再使用。
 
(2). 细胞培养过程中,吸取过培养液的吸管不能再用火焰烧灼,防止残留在吸管内的培养基焦化,将有害物质带入培养液中。
 
(3). 尽量缩短各种液体、细胞的暴露时间。
 
(4). 避免液体间、细胞间的交叉污染。
 
(5).配制完全培养基时,配制的量最好在2周内用完为好。
 
81、血清的有关问题
 
新生牛血清:新出生牛5天内取血制成
小牛血清:小牛出生16周以内采血制成。
胎牛血清:(进口血清)要求剖腹取胎制成。
国内厂家往往不能做到,经常把出生2天以内采血称为胎牛血清。
根据血清的生产工艺及血红蛋白、内毒素含量又分为:
 
(1).特级胎牛血清:40纳米过滤,内毒素含量≤10 EU,血红蛋白含量≤10 mg/dl。
 
(2).优等胎牛血清:经过3次100纳米过滤,内毒素含量≤25 EU/ml,血红蛋白含量≤25 mg/ml。
 
(3).标准胎牛血清:3次100纳米过滤,低内毒素,低血红蛋白含量。
 
(4).活性碳/葡聚糖处理血清:激素含量大大降低。
 
(5).透析型胎牛血清:次黄嘌呤和胸腺核苷含量大大降低。

82、其他细胞培养用液:除培养基、血清、谷氨酰胺外,其他几种液体也属必须,不可省略。
 
(1).双抗:200倍,(1 ml/支)其终浓度为青霉素100 U/ml;链霉素100 ug/ml,-24 ℃保存。
 
(2).L-谷氨酰胺:100倍,(1 ml/支), 终浓度2 mM,-24 oC保存。
 
(3).丙酮酸钠:配制浓度50 mM,4 ml/支,终浓度为1 mM/ml,-24 ℃保存。
 
(4).Hepes液:配制浓度1 M(5ml/支),一支Hepes加入到200 ml完全培养基中,终浓度为25 mM/ml,常温保存。

83、支原体污染及检测
 
(1).支原体污染在细胞培养中最常见、不易被查觉,但支原体污染可显著影响细胞功能干扰实验结果。支原体是介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的最小微生物,它无细胞壁,形态呈高度多形性,最小直径0.2 um,可通过滤器。
 
目前中心通过对国内100余株/系细胞的检测,形势不容乐观。污染率达30% ~ 60% 。课题组从国外引进细胞株/系也经常出现支原体的污染。支原体在污染细胞后,它通过影响细胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培养基中的氨基酸来抑制细胞的生长,并能降低细胞的融合率。因此,在运用各种细胞系进行实验研究时,首先要证明所用细胞有无支原体的污染。
 
(2).支原体污染后,培养基可不发生浑浊,细胞病变轻微或不明显,因此难以发现。目前,支原体检测的方法有以下几种。
 
(a).相差显微镜观察;

(b).低张处理地衣红染色法;

(c).荧光染色法;(d).酶标法;

(e).PCR法:基础医学细胞中心使用该方法进行检测。
优点:灵敏度高,检测耗时短,样品量小
(只需50 ul细胞培养用液上清)。
缺点:引物及制剂费用较高。

84、培养液pH 值变化太快
 
可能原因
 
(1)CO张力不对。
 
(2)培养瓶盖拧得太紧。
 
(3)NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足。
 
(4)培养液中盐浓度不正确。
 
(5)细菌、酵母或真菌污染。
 
建议解决方法
 
(1)按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度,2.0 g/L 到3.7 g/L 浓度NaHCO3 对应CO2 浓度为5%到10%。
 
(2)松开瓶盖1/4 圈。
 
(3)改用不依赖CO2 培养液。加HEPES 缓冲液至10 到25 mM 终浓度。
 
(4)在CO培养环境中改用基于Earle′s 盐配制的培养液,在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液。
 
(5)丢弃培养物,或用抗生素除菌。
 
85、培养液出现沉淀,但pH值不变
 
可能原因
 
(1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐,将培养基成分沉淀下来。
 
(2)冰冻保存培养液。
 
建议解决方法

(1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿,然后灭菌。

(2)将培养液加热到37℃,摇动使其溶解如沉淀仍然存在,丢弃培养液。
 
86、培养液出现沉淀, 同时pH 发生变化
 
可能原因
 
细菌或真菌污染。
 
建议解决方法
 
丢弃培养物,或用抗生素除菌。
 
87、培养细胞不贴壁
 
可能原因
 
(1)胰蛋白酶消化过度。
 
(2)支原体污染。
 
(3)培养瓶瓶底不干净。
 
(4)培养液pH值过碱(NaHCO3分解)。
 
(5)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不当。
 
(6)细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性)。
 
(7)接种细胞起始浓度太低或太高。
 
建议解决方法
 
(1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。
 
(2)分离培养物,检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染,丢弃培养物。
 
(3)注意刷洗,或换用一次性塑料培养瓶。
 
(4)使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2(将培养液敞口放入培养箱也可)
 
(5)重新配置消化液或培养液。
 
(6)启用新的保种细胞。
 
(7)调节最佳接种细胞浓度。
 
88、悬浮细胞成簇
 
可能原因
 
(1)培养液中含钙、镁离子。
 
(2)支原体污染。
 
(3)蛋白酶过度消化使得细胞裂解释。
 
(4)DNA污染。
 
建议解决方法
 
(1)用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞,轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。
 
(2)分离培养物,检测支原体。如发现支原体污染,丢弃培养物。
 
(3)用DNase I 处理细胞。
 
89、原代细胞培养物污染
 
可能原因
原代培养组织在进入培养前已污染。
 
建议解决方法
培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织。
 
90、培养细胞生长减慢
 
可能原因
 
(1)由于更换不同培养液或血清。
 
(2)培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏。
 
(3)培养物中有少量细菌或真菌污染。
 
(4)试剂保存不当。
 
(5)接种细胞起始浓度太低。
 
(6)细胞已老化。
 
(7)支原体污染。
 
建议解决方法
 
(1)比较新培养液与原培养液成分,比较新血清与旧血清支持细胞生长实验。让细胞逐渐适应新培养液。
 
(2)换入新鲜配制培养液,或补加谷氨酰胺及生长因子。
 
(3)用无抗生素培养液培养,如发现污染,丢弃培养物。或用抗生素除菌。
 
(4)血清需保存在-5 ℃ 到-20 ℃。培养液需在2-8 ℃避光保存。含血清完全培养液在2-8 ℃保存,并在2 周内用完。
(5)增加接种细胞起始浓度。
 
(6)换用新的保种细胞。
 
(7)分离培养物,检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染,丢弃培养物。
 
91、培养细胞死亡
可能原因
 
(1)培养箱内无CO2。
 
(2)培养箱内温度波动太大。
 
(3)细胞冻存或复苏过程中损伤。
 
(4)培养液渗透压不正确。
 
(5)培养液种有毒代谢产物堆积。
 
(6)更多原因参考问题4和问题7。
 
建议解决方法
 
(1)检测培养箱内CO2
 
(2)检查培养箱内温度
 
(3)取新的保存细胞种
 
(4)检测培养液渗透压。注意:大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为260 - 350 mOsm/kg。加入额外试剂如HEPES或药物都有可能影响培养液渗透压。
 
(5)换入新鲜培养液
 

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