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  • 加尾法miRNA第一链合成试剂盒(货号:MF0201)
  • 加尾法miRNA第一链合成试剂盒(货号:MF0201)

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    • 试剂规格:
    • 25T
CAS:
-


产品货号MF0201

储存温度-20

产品组成

组成

MF0201

miRNA RT Enzyme Mix

50 ul

2 × miRT Reaction Mix

250 ul

RNase free H2O

1 ml


制品说明

miRNA第一链合成试剂盒本试剂盒采用在Poly(A)加尾法原理,首先miRNA 3’末端加Poly(A)尾,再使用Anchored oligo(dT)-universal tag通用逆转录引物进行逆转录反应,最终生成miRNA对应的cDNA第一链。本试剂盒采用特殊优化预混mixPoly(A)加尾和反转录合并为一步完成,简化了操作步骤并提高Poly(A)加尾和逆转录效率,该试剂盒具有可从20pg-2ugtotal RNA中有效制备miRNA对应的cDNA第一链。一次合成的cDNA可检测多个microRNA,节约了样品和成本。

注:该试剂盒须与miRNA增强型荧光定量检测试剂盒(MR0201)配套使用

操作步骤

一、miRNA3’末端进行Poly (A)加尾和逆转录反应(第一链合成)

1解冻2 × miRNA RT Reaction Mix并混匀,miRT Enzyme Mix放于冰中备用,加入以下试剂至总体积20μl(最后加入miRNA RT Enzyme Mix) 

Components

Volume

Final Concentration

Total RNA

x μl

Up to 2μg

2 × miRT Reaction Mix

10 μl

1 ×

miRNA RT Enzyme Mix

μl (见注意事项)

-

RNase free H2O to final volume

20 μl

-


注意事项:

(1)miRNA RT Enzyme Mix非常粘稠,溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失,用前请点甩离心,并且避免吸头外壁沾附损失。Enzyme Mix内酶都是过量的,即使每次按照 1.8μl使用,也不影响使用效果。

2)在反应中使用的total RNA 必须包含有小分子RNA(miRNA)。此过程也可以使用富集的miRNA,单纯miRNA无法直接用分光光度计定量,建议直接加入2μl ~5μl。可根据目的miRNA丰度决定加入量,但是对于低丰度miRNA 样品而言(如血清血浆提取物),可直接加入最大体积8μl。

2、移液器轻轻混匀上述配制的反应液,短暂离心后在42℃反应60 min。

3、85℃加热5秒钟失活E.coli Poly(A) Polymerase 和 Labscript Hˉ RTase。合成的cDNA反应液可放置于-20℃保存;也可以直接进行下游PCR或者荧光定量PCR检测。

二、按照LABLEAD miRNA增强型荧光定量试剂盒(货号:MR0201)进行定量 PCR。

注:按照上述操作步骤得到的cDNA模板用于下游PCR或者荧光定量PCR检测时,可以根据实际情况选择使用量,对于特殊的检测体系中,高含量的cDNA 模板易导致非特异性扩增,可根据所检测miRNA 的丰度适当的稀释cDNA(5-10倍或者100倍)后使用。如果发现有非特异扩增条带,或者融链曲线显示有非特异扩增,往往提示cDNA模板过量, 可以尝试将上述cDNA模板稀释几十到几百倍甚至上千倍再使用。


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