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  • 快速内切酶AscI(货号:F5508S)
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CAS:
-

产品货号F5508s

储存条件-20℃                                      

同裂酶:PalAI, SgsI

注:同裂酶对于不同的甲基化修饰也许具有不同敏感性。

产品组成

组分

规格

LabFD™ AscI

50ul

10×LabFD™ Buffer

1ml

10×LabFD™ Color Buffer

1ml


产品简介

LabFD™快速内切酶是一系列经过基因工程重组、能够在5~15分钟内精确完成DNA切割的高保真限制性内切酶,适用于质粒DNA、PCR产物或基因组DNA等的快速酶切LabFD™快速内切酶具有如下特点:5~15分钟内即可完成酶切;共用一种酶切Buffer,大大简化酶切反应体系;良好的酶活冗余度,轻松应对底物过量或困难模板酶切。此外,LABLEAD去磷酸化、连接试剂在LabFD™酶切Buffer中具有100%活性,支持一管化反应,提升“酶切-修饰-连接”的体验。

建议反应条件

1×LabFD™缓冲液;

37℃温育;

参照“DNA快速酶切流程”配制反应体系。

失活条件

80℃温育20min。

质量控制

功能活性检测

最适反应温度下,在20ul反应体系中,1ul LabFD™ AscI能够在15min内完全消化1ug  λDNA(HindIII digest)

超长时间温育检测

最适反应温度下,将1ul LabFD™ AscI与1ug λDNA(HindIII digest共同温育3h,未检测到其他核酸酶污染或星号活性引起的底物非特异性降解,延时酶切可能出现星号活性。

酶切-连接-再酶切检测

最适反应温度下,使用1ul LabFD™ AscI消化底物,回收酶切产物。在22℃下使用适量Fast T4 DNA Ligase可以将酶切产物重新连接。将连接产物再次回收后,使用相同的内切酶可以重新切开连接产物。

非特异性内切酶活性检测

最适反应温度下,将1ul LabFD™ AscI与1ug超螺旋质粒DNA共同温育4h,使用琼脂糖凝胶电泳检测,质粒DNA仍然处于超螺旋状态。

蓝白斑检测

将含有单一lacZα基因的载体以1ul LabFD™ AscI消化,重新连接后转化入大肠杆菌感受态细胞,涂布在含有对应抗生素、IPTG和X-gal的LB培养基平板上。连接正确的产物会生长出蓝色菌落,而连接错误(即 DNA 末端切口不完整)的产物将得到白色菌落。对于 LabFD™系列限制酶而言,白色菌落比例应小于1%。

使用方法

1.DNA快速酶切流程

1)在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系:


质粒DNA

PCR产物

基因组DNA

ddH2O

15ul

16ul

30ul

10×LabFD™ Buffer或10×LabFD™ Color Buffer

2ul

3ula

5ul

底物DNA

2ul(up to 1ug)

10ul(~0.2ug)

10ul(5ug)

LabFD™  AscI

1ul

1ul

5ul

Total

20ul

30ul

50ul

注:本体系适用于经过纯化的PCR产物酶切,未纯化的PCR具备一定的离子强度,10xLabFDTMbuffer加入量可适当减少至2ul。但由于DNA聚合酶同时具有外切酶活性,会影响酶切产物,因此如下一步需进行克隆等操作,建议酶切前对PCR产物进行纯化。

2)轻柔吸打或轻弹管壁以混匀(切勿涡旋),然后瞬时离心以收集挂壁液滴;

3)37℃温育15min(质粒),或15~30min(PCR产物),或30~60min(基因组DNA);

4)80℃温育20min即可使酶失活,停止反应。

2.双酶切或多酶切

1)每种快速内切酶的用量为1ul,并根据需要适当扩大反应体系;

2)所有快速内切酶的体积总和不得超过总反应体系的1/10;

3)如果所用的几种快速内切酶的最适反应温度不同,应先以最适温度低的酶开始酶切,再添加最适温度较高的酶,在其最适反应温度下进行酶切反应。

3.适用于质粒的扩大反应体系

DNA

1ug

2ug

3ug

4ug

5ug

LabFD™ AscI

1ul

2ul

3ul

4ul

5ul

10×LabFD™ Buffer或10×LabFD™ Color Buffer

2ul

2ul

3ul

4ul

5ul

Total

20ul

20ul

30ul

40ul

50ul

注:如果总反应体系大于20ul,应适当增加温育时间,尽量使用水浴、金属浴或沙浴。

不同DNA中的酶切位点数量

λDNA

ΦX174

pBR322

pUC57

pUC18/19

SV40

M13mp18/19

Adeno2

2

0

0

0

0

0

0

2

甲基化修饰影响

Dam

Dcm

CpG

EcoKI

EcoBI

无影响

无影响

序列完全重叠

剪切阻断

无影响

无影响

在不同反应缓冲液中的活性


LabFD™ Buffer

Thermo Scientific

FastDigest Buffer

NEB

CutSmart®Buffer

Takara

QuickCut™Buffer

活性

100%

100%

100%

100%

注:活性数据来自LABLEAD限制酶标准反应体系下的检测。


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