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  • 快速内切酶 AgeI(货号:F3501S)
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CAS:
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产品货号:F3501S

储存条件:-20℃

 

同裂酶:AsiGI, CspAI, BshTI, PinAI;(注:同裂酶对于不同的甲基化修饰可能具有不同敏感性。)

产品组成

组分

规格

LabFD™ AgeI

25ul

10×LabFD™ Buffer

1ml

10×LabFD™ Color Buffer

1ml

产品简介

LabFD™ 快速内切酶是一系列经过基因工程重组的快速限制性内切酶,适用于质粒 DNA、PCR 产物或基因组 DNA 等的快速酶切。

所有 LabFD™ 快速内切酶在通用的LabFD™或LabFD™ Color Buffer中都具有优良的活性,能够在 5~15 分钟内完成酶切。此外,兰博利德去磷酸化、连接试剂在LabFD™ Buffer 中均具有 100% 活性,支持一管化反应,提升“酶切-修饰-连接”的体验。LabFD™ Color Buffer 包括红色和黄色示踪染料,可将产物直接用于凝胶电泳。LabFD™ Color Buffer 的红色染料与 2500 bp 双链DNA 片段在 1% 琼脂糖凝胶中迁移速率接近;黄色染料与 10 bp双链 DNA 片段在 1% 琼脂糖凝胶中迁移速率接近。

 

建议反应条件

1×LabFD™缓冲液;37℃温育;参照“DNA 快速酶切流程”配制反应体系。

失活条件

80℃温育 20 min。


质量控制

功能活性检测

最适反应温度下,在 20ul 反应体系中,1ul LabFD™ AgeI 能够在 15min 内完全消化 1ug p615 DNA。

超长时间温育检测

最适反应温度下,将 1ul LabFD™ AgeI 与 1ug p615 DNA共同温育 3h,未检测到其他核酸酶污染或星号活性引起的底物非特异性降解,延时酶切可能出现星号活性。

酶切-连接-再酶切检测

37℃下,使用 10 倍酶量的 LabFD™ AgeI 消化 DNA 底物,回收酶切产物,在 22℃下使用 T4 DNA Ligase (Fast) 可以将超过95% 的酶切产物重新连接。将连接产物再次回收后,使用相同的内切酶可以重新切开 95% 以上的连接产物。

非特异性内切酶活性检测

最适反应温度下,将 1ul LabFD™ AgeI 与 1ug 超螺旋质粒 DNA 共同温育 4h,使用琼脂糖凝胶电泳检测,质粒 DNA 仍然处于超螺旋状态。

蓝白斑检测

使用 1μl  LabFD™ AgeI消化含有 lacZα 基因且仅在该基因上具有1个酶切位点的特定载体。将酶切产物重新连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中,涂布在含有X-gal、IPTG 和相应抗生素的LB平板培养基上生长。成功连接的β-半乳糖苷酶基因可以正确表达,并生长出蓝色菌落;而因酶切末端降解等原因未能重新连接的产物将得到白色菌落。对于 LabFDTM 系列限制酶而言,白色菌落的比例应当小于 1%。

使用方法

1.DNA 快速酶切流程

(1)在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系:


质粒 DNA

PCR 产物

基因组 DNA

ddH2O

15ul

16ul

30ul

10×LabFD™ Buffer 或 10×LabFD™ Color Buffer

2ul

3ula

5ul

底物 DNA

2ul(up to 1ug)

10ul(~0.2ug)

10ul(5ug)

LabFD™ AgeI

1ul

1ul

5ul

Total

20ul

30ul

50ul

a. 本体系适用于经过纯化的 PCR 产物酶切。未纯化的 PCR 产物具备一定的离子强度,10× LabFD™ Buffer 加入量可适当减少至2μl。但由于DNA 聚合酶同时具有外切酶活性,会影响酶切产物,因此如下一步需进行克隆等操作,建议酶切前对PCR产物进行纯化。

(2)轻柔吸打或轻弹管壁以混匀(切勿涡旋),然后瞬时离心以收集挂壁液滴;

(3)37℃温育 15min(质粒),或 15~30min(PCR 产物),或 30~60min(基因组 DNA);

(4)80℃温育 20min 即可使酶失活,停止反应(可选)。

(5)如果使用 LabFD™ Color Buffer 进行酶切反应,得到的产物可以直接进行上样电泳。

2.双酶切或多酶切

(1)每种快速内切酶的用量为 1ul,并根据需要适当扩大反应体系;

(2)所有快速内切酶的体积总和不得超过总反应体系的 1/10;

(3)如果所用的几种快速内切酶的最适反应温度不同,应先以最适温度低的酶开始酶切,再添加最适温度较高的酶,在其最适反应温度下进行酶切反应。

3.适用于质粒的扩大反应体系

注:如果总反应体系大于 20ul,应适当增加温育时间,尽量使用水浴、金属浴或沙浴。

DNA

1ug

2ug

3ug

4ug

5ug

LabFDTM AgeI

1ul

2ul

3ul

4ul

5ul

10×LabFD™ Buffer 或 10×LabFD™ Color Buffer

2ul

2ul

3ul

4ul

5ul

Total

20ul

20ul

30ul

40ul

50ul

不同 DNA 中的酶切位点数量

λDNA

ΦX174

pBR322

pUC57

pUC18/19

SV40

M13mp18/19

Adeno2

13

0

0

0

0

0

0

5

甲基化修饰影响

Dam

Dcm

CpG

EcoKI

EcoBI

无影响

无影响

剪切受阻

无影响

无影响

在不同反应缓冲液中的活性


LabFD™ Buffer

Thermo Scientific

FastDigest Buffer

NEB CutSmart®Buffer

Takara

QuickCut™Buffer

活性

100%

100%

100%

50%

注:活性数据来自 LABLEAD 限制酶标准反应体系下的检测。

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