产品货号：D22031

储存温度：−20°C干燥避光。有效期2年

产品描述

DiD，DiO，DiI，DiR和DiS染料是一族亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强，这类染料有着很高的淬灭常数和激发态寿命。一旦对细胞染色，这类染料在整个细胞膜上扩散，最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。它们的荧光颜色区分明显：DiI（橙色荧光），DiO（绿色荧光），DiD（红色荧光）和 DiR （深红色荧光）这使得他们可以用来对活细胞进行多色成像和流式分析。DiI和DiO可以分别用标准的 FITC和TRITC的滤光片。DiD可以用 633 nm He–Ne 激光器激发，有着比DiI更长的激发波长和发射波长，在细胞和组织染色中更有价值。 DiR的红外荧光可以穿透细胞和组织，在活体成像中用来示踪。

表1.  DiD，DiO，DiI，DiR，DiS的化学性质

* Omega滤光器由Omega公司提供（www.omegafilters.com）；Chroma滤光器由Chroma公司提供（www.chroma.com）。

**DiR的发射波长肉眼不可见，所以需要配备CCD镜头或其他的近红外检测仪器。

使用方法 1. DiD，DiO，DiI，DiR 和 DiS 细胞膜染色液制备 

（1）配置 DMSO 或 EtOH 储存液：储存液用 DMSO 或 EtOH 配置浓度 1～5 mM。

注意：未使用的储存液保存在-20°C，避免反复冻融。 

（2）工作液制备：用合适的缓冲液（如：无血清培养基，HBSS 或 PBS）稀释储存液，配制浓度为 1～5 µM 的工作液。

注意：工作液的最终浓度是根据不同细胞和实验的经验来配制。可以从推荐浓度的十倍以上寻找最佳条件。

2. 悬浮细胞染色 

（1）将细胞悬浮与无血清培养基中，悬浮细胞密度为 1 × 106/mL，每1ml 加入5ul工作液；

（2）在 37 ℃培养细胞 2～20 分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。 

（3）染色细胞试管在 1000～1500 转离心 5 分钟。 

（4）弃去上清液，用 37℃的培养基轻轻悬浮细胞；

（5）重复（3），（4）步骤两次以上。；

（6）放置 10 分钟后测定荧光信号。

3. 贴壁细胞的染色 

（1）放置干净的载玻片在培养皿内，让细胞爬片生长至合适浓度；

（2）取出爬片，用吸水纸从边缘轻轻吸去多余的培养基，然后将爬片放置于湿盒内；

（3）配制染色液：每 1ml 培养基加入 5µl 细胞染色液；

（4）用移液器吸取 100µl 步骤 （3）中配制好的染色液，从边角处加入爬片，轻轻摇动使所有染色液覆盖整个爬片；

（5）将爬片置于 37℃孵育，不同类型的细胞孵育的时间不尽相同；一般细胞建议孵育时间设为 20 分钟，然后再进行优化以获得均一的染色效果；

（6）吸去染色液，加入温育过的培养基孵育 10 分钟，重复此洗涤步骤三次。

4. 显微镜检测 

（1）DiD，DiO，DiI，DiR 和 DiS 滤光器的选择参见表 1。 

（2）多色染料的同时检测，滤光器按照以下设定：

a) DiI 和 DiO＝Omega XF52，Chroma 51004；

b) DiI 和 DiD＝Omega XF92，Chroma 51007；

c) DiI，DiO 和 DiD＝Omega XF93，Chroma 61005 

5. 流式细胞仪的检测 

DiD，DiO，DiI，DiR 和 DiS 染色的细胞可以分别用经典的 FL1，FL2，FL3 和 FL4 流式细胞仪检测。