货号：D1096
规格：24/96次
产品概述
本产品是针对 Illumina 高通量测序平台开发的建库试剂盒，采用了转座酶对基因组DNA（gDNA）和 cDNA通过一步法将其制备成适配高通量测序的文库。本产品针对 50 ng、5 ng和1 ng DNA 起始量分别推出了三种试剂盒规格，使用者可根据实际需求自行选择所需试剂。
自备材料
PCR 仪；
DNA Cleanup Beads；
磁力架；
无水乙醇；
PCR 管；
移液器及对应吸头；
无酶无菌ddH2O。
实验流程概要
注意事项
1. 由于TTE对DNA非常敏感，因此推荐使用Qubit法对gDNA/cDNA浓度进行精确定量，请避免使用任何基于吸光度的检测方法。
2. 针对不同起始量DNA，请使用相对应的TTE，不可混用，否则会造成文库片段过大/过小甚至产出失败！
3. 所有反应体系都应在冰上进行，否则会影响实验结果。
4. 所有试剂应避免反复冻融。
5. 请根据测序试剂版本（咨询测序公司）填写用于拆分子文库数据的Barcode序列。
实验流程
1. DNA 准备：
gDNA 或 cDNA 应溶于无酶无菌水或者 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）中。
2. DNA片段化
a.试剂配置：
5×TD buffer和TTE-50 ng/TTE-5 ng/TTE-1 ng 轻轻混匀，瞬离后置于冰上；
低温条件下，在PCR管中按照下表配置反应体系：
组分 | 体积 |
gDNA/cDNA | x μL |
5×TD buffer | 2 μL |
TTE-50ng/TTE-5ng/TTE-1ng | 1 μL |
ddH2O | to 10 μL |
b.移液器轻轻吹吸10次混匀反应体系，避免产生气泡。
c.在 PCR 仪设置以下程序并运行：
温度 | 时间 |
55℃ | 10 min |
4℃ | hold |
55℃ | 热盖 |
注：此步反应结束后应立即进行下步反应，否则会导致文库片段偏小。
3. 片段化产物PCR富集
a. 将上一步反应产物置于冰上，按照下表配置反应体系：
组分 | 体积 |
上一步反应体系 | 10 μL |
TAE mix | 12.5 μL |
N7 index primer | 1 μL |
N5 index primer | 1 μL |
ddH2O | 0.5 μL |
total | 25 μL |
b. 移液器轻轻吹吸10次或轻弹管壁以混匀反应体系，避免产生气泡。
c. PCR 仪设置并运行以下程序：
温度 | 时间 | 循环数 |
72℃ | 5 min | 1 |
98℃ | 30 sec | 1 |
98℃ 65℃ 72℃ | 10 sec 10 sec 10 sec | 10-14 |
72℃ | 5min | 1 |
4℃ | hold | 1 |
105℃ 热盖 | ||
50 ng 和 5 ng 起始量，推荐10-12 cycle；1 ng 起始量，推荐12-14 cycle；可根据实际情况调节循环数。
第一步72℃ 5 min 用于进行 Gap filling反应，请勿删除该步骤，否则会造成文库富集失败。
4. 文库片段筛选：
a. 使用 beads 对PCR产物进行片段筛选前，请先将 beads涡旋震荡混匀并平衡至室温。
b. 向 PCR 产物中加入足够的ddH2O，保证体积略大于25 μL；混匀后准确吸取 25μL 到新的 PCR 管中。
c. 向 25 μL PCR 产物中加入 12.5 μL（0.5×） beads，充分吹吸/震荡混匀后，瞬时离心，室温孵育 10 min。
d. 将上一步管移至磁力架上，待溶液澄清后将上清转移至新的 PCR 管中，加入12.5 μL（0.5×）beads，充分混匀后，室温静置 10 min。
e. 将上一步管移至磁力架上，待溶液澄清后小心吸弃上清。
f. 在磁力架上，向PCR管中加入200μL 新鲜配置的 80% 乙醇，孵育 30 sec，小心吸去乙醇。
g. 重复上一步骤，共漂洗beads 2 次。
h. PCR管瞬时离心，在磁力架上用 10 μL 吸头吸弃残留的乙醇。
i. 磁力架上，室温干燥 beads约 2-5 min至beads开始无光泽。
j. 待beads干燥后，加入 20 μL Elution buffer，重悬 beads，室温孵育 10 min。
k. 将PCR产物进行瞬时离心，置于磁力架上。待溶液澄清后，小心吸取上清文库到新管中，-20℃ 保存或利用Illumina测序仪进行测序。
5. 文库质检
a. 对文库进行 Qubit 浓度测定。
b. 对文库进行 Agilent 2100 检测。
6. Index primer序列
引物 | 序列 | 引物上Index序列 |
N7 index primer1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGATCGCGTCTCGTGGGCTCGG | TAGATCGC |
N7 index primer2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTCTCTATGTCTCGTGGGCTCGG | CTCTCTAT |
N7 index primer3 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTATCCTCTGTCTCGTGGGCTCGG | TATCCTCT |
N7 index primer4 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGAGTAGAGTCTCGTGGGCTCGG | AGAGTAGA |
N7 index primer5 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAAGGAGGTCTCGTGGGCTCGG | GTAAGGAG |
N7 index primer6 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACTGCATAGTCTCGTGGGCTCGG | ACTGCATA |
N7 index primer7 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGGAGTAGTCTCGTGGGCTCGG | AAGGAGTA |
N7 index primer8 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGCCTGTCTCGTGGGCTCGG | CTAAGCCT |
N7 index primer9 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGAAATCGTCTCGTGGGCTCGG | TGGAAATC |
N7 index primer10 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACATGATGTCTCGTGGGCTCGG | AACATGAT |
N7 index primer11 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGATGAAAGTCTCGTGGGCTCGG | TGATGAAA |
N7 index primer12 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCGGACTGTCTCGTGGGCTCGG | GTCGGACT |
N5 index primer1 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCGCTCGTCGGCAGCGTC | TAGATCGC |
N5 index primer2 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATTCGTCGGCAGCGTC | CTCTCTAT |
N5 index primer3 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATCCTCTTCGTCGGCAGCGTC | TATCCTCT |
N5 index primer4 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGAGTAGATCGTCGGCAGCGTC | AGAGTAGA |
N5 index primer5 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTAAGGAGTCGTCGGCAGCGTC | GTAAGGAG |
N5 index primer6 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTGCATATCGTCGGCAGCGTC | ACTGCATA |
N5 index primer7 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGGAGTATCGTCGGCAGCGTC | AAGGAGTA |
N5 index primer8 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTAAGCCTTCGTCGGCAGCGTC | CTAAGCCT |
