货号：D0204P

存储温度：-20°C

产品组分

产品简介

基于重组原理的无缝克隆技术，作为新一代的克隆方法，不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平等操作，依据DNA片段与线性化载体末端的15~25nt同源序列的重组，可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点，载体自连背景极低，是一种简单、快速、高效的DNA定向克隆技术。

DNA Assembly Mix PLUS 无缝克隆试剂盒，一次反应可完成单至多个 DNA 片段的重组，最快仅需 5 分钟即可完成单片段重组，且阳性率高于 95%。Mix 中使用 HiFi Taq DNA Ligase，相较于普通的Taq DNA Ligase，拥有更高的保真度，显著提高无缝克隆成功率。同时，Mix 中还添加了转化增强剂，大幅提高转化子数量。在保证保真度和转化效率的情况下，DNA Assembly Mix PLUS 进一步优化了组分，使其稳定性显著提高，可以耐受热、氧环境。

使用简单——兼容PCR与酶切体系，省去繁琐的纯化步骤

超高效率——可以稳定支持5-6片段在同一克隆体系

稳定可靠——37℃放置一周或冻融30次，无明显下降

产品应用

快速克隆；多片段 DNA 组装；DNA 定点突变。

实验步骤

1、实验流程概要

2. 线性化克隆载体制备

选择合适的克隆位点，对载体进行线性化，载体的线性化可以通过酶切或反向 PCR 扩增完成。

① 酶切制备

推荐使用LabFD™快速内切酶进行双酶切，使载体线性化完全，以降低转化背景(假阳性克隆)；若使用单酶切进行线性化，可以适当延长酶切时间以减少环状质粒残留。

注1：经双酶切进行线性化的载体无需去磷酸化，经单酶切则需要去磷酸化；

注2：酶切完成后，应将快速内切酶失活或对目的产物纯化后再用于重组反应。

注 3：载体胶回收时建议长时间电泳与残留的环状质粒区分开后再切胶，以减少假阳性率。

② 反向 PCR 扩增制备

为减少扩增突变的引入，推荐使用高保真PCR Mix进行扩增。推荐使用预线性化质粒作为模板，以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。

注 1：PCR 产物无非特异性条带时，推荐使用LabFD™ DpnI ( 货号：F5585S) 1 μl 加入 50 μl PCR 产物中 37℃ 1 h，80℃ 20 min 消化质粒模板即可用于重组反应；反之建议将 PCR 产物胶回收后使用。

注 2：多片段克隆时，建议将 PCR 产物纯化后使用。

3. 插入片段PCR引物设计

PCR引物的5' 端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端同源的15~25 nt（推荐18nt）序列。假如载体为粘性末端，且3'端突出，则引物设计必须包含突出部分；若5'端突出，则引物设计可以包含突出部分，也可以不包含。

插入片段正向扩增引物：

5'—上游载体末端同源序列+酶切位点（可选）+ 基因特异性正向扩增序列—3'

插入片段反向扩增引物：

3'—基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可选）+下游载体末端同源序列—5'

注1：尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆，当载体克隆位点上下游25 nt区域内GC含量为40%~60%时，重组效率最高；

注2：本试剂盒所提供的 pUC 19 载体（Ampr）连接端序列如下：

注 3：包含多个重复序列的片段无法采用无缝克隆的策略进行连接。

4. 插入片段的 PCR 扩增

推荐使用高保真PCR Mix进行扩增，以减少扩增突变的引入。建议使用纯化后的PCR产物进行无缝克隆反应，若PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物，可直接使用，但加样体积不应超过总反应体积的20%。

5. 重组反应

① 于冰水浴中配置以下反应体系：

重组反应体系配制完成后，用移液枪轻轻吸打混匀各组分，避免产生气泡，切勿涡旋。

a.最适载体用量(ng)=0.02×载体碱基对数，即0.03 pmol。

b.插入单片段，最适片段用量（ng）= 0.04×片段碱基对数；插入多片段，每片段最适用量（ng）=0.02×片段碱基对数。

c.阴性对照可用来确认线性化载体中是否有环状质粒残留，推荐进行。

d.阳性对照可用来排除其它实验材料及操作因素的影响。

注 1：若插入单片段长度大于载体，则应互换载体与插入片段用量；

注 2：若插入片段长度小于200 bp，则插入片段应使用5倍载体用量；

注 3：若按上述公式计算得到的用量超过最低/最高值，则建议直接按最低/最高用量使用；

注 4：载体片段过长、插入片段过长或片段数过多，克隆菌落数和阳性率均会降低。

② 将反应体系置于50℃，反应5~15min。

注 1：推荐使用 PCR 仪等温控比较精准的仪器进行反应，反应时间不足或太长克隆效率均会降低；

注 2：插入1-2个片段时，推荐反应时间5-15min，插入3-5个片段时，推荐反应时间30min；

注 3：当载体骨架在 10 kb 以上或插入片段在4 kb以上时，建议延长反应时间到30-60min；

注 4：50℃反应完成后，建议进行瞬时离心，将反应液收集至管底。

③ 将反应液离心管置于冰上冷却，之后进行转化或者储存于-20℃。

注 1：-20℃储存的重组产物，建议在1周内使用。

6. 重组产物转化

取5~10μl反应液，加入到100 μl感受态细胞中，缓慢吸打混匀，冰上放置30 min。42℃热激60 s，冰浴5 min。加500μl SOC或LB培养基，37℃振荡培养50~60 min（200 rpm）。将菌液均匀涂布在含有对应抗生素的平板上，倒置于37℃过夜培养。

注1：不同感受态细胞最后的克隆阳性率会有所差别，推荐使用转化效率>108 CFU/μg的感受态细胞；

注2：菌落数取决于PCR产物与线性化载体的数量和纯度；

注3：阳性对照平板通常生长大量白色单菌落，阴性对照平板只生长很少的菌落。

7. 阳性克隆检测

挑取单菌落至10μl ddH₂O中混匀，95℃裂解10 min后，取1μl裂解液作为模板，进行菌落PCR鉴定，或将单菌落接种至抗性培养基中培养过夜后，提取质粒进行酶切鉴定。

阳性对照的阳性克隆检测，菌落 PCR 引物使用通用引物 M13F 与M13R，酶切鉴定用 HindIII 与 EcoRI。

注 1：菌落 PCR 时建议至少使用一条通用引物，避免假阳性结果；

注 2：必要时可进一步对阳性结果进行测序鉴定。

注3：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13R：CAGGAAACAGCTATGAC