条带不清晰

信号弱

封闭剂不当

封闭剂可能对目标蛋白质具有亲和力，因此会掩盖蛋白质的检测。尝试不同的封闭剂和/或减少封闭剂的用量或暴露时间。

抗体反应时间不足

增加孵育时间。

抗体浓度过低或抗体无活性

抗体溶液的多次冻融或细菌污染会改变抗体滴度或活性，增加抗体浓度或新鲜制备。

试剂过期

使用新鲜的底物并妥善储存。过期的底物会降低灵敏度。

蛋白转印问题

优化蛋白转印过程

显色检测时膜上印记干了

如果使用显色检测系统时对比度较差，则印迹可能已经干燥。尝试在水中重新润湿印迹以最大限度地提高对比度。

自来水使显色检测试剂失活

使用去离子水进行试剂制备

叠氮化物抑制 HRP

不要在印迹溶液中使用叠氮化物

抗原浓度过低

增加上样量

无信号

没有条带

抗体浓度过低

增加一抗和二抗的浓度。

HRP 抑制

HRP 标记的抗体不应用于含有叠氮化钠的溶液中。

一抗针对抗原

在非变性凝胶中分离蛋白质，或使用针对变性抗原的抗体。

印迹不均匀

印迹上有指纹、折叠痕迹或镊子印记

避免触摸或折叠膜;使用手套和钝端镊子

曝光后膜面蛋白位置发黄

显影过曝

显影液灵敏度高，更换低敏的显影液。

斑点背景

封闭试剂中的聚集体

通过过滤装置过滤封闭试剂溶液。弱封闭剂是奶粉，需要充分溶解，

HRP 偶联二抗中的聚集体

通过过滤器单元过滤二抗溶液。

高背景

洗涤不足

增加洗涤量和时间。使用过滤装置对所有溶液（包括转移缓冲液）进行预过滤。

二抗（酶偶联）浓度过高

增加抗体稀释度。

蛋白质-蛋白质相互作用

在洗涤液和检测液中使用 Tween-20 （0.05%） 以最大限度地减少蛋白质-蛋白质相互作用并提高信噪比。

试剂质量差

使用高质量试剂和 Milli-Q水。

封闭试剂和抗体之间的交叉反应性

更换封闭剂或在洗涤缓冲液中使用 Tween-20 洗涤剂。

胶片过度曝光

减少曝光时间

孵育过程中的膜干燥了

在孵育过程中，使用足以覆盖膜的体积。

抗体质量差

使用高质量的亲和纯化抗体

检测试剂过量

曝光前尽量减少印记膜面水分

非特异性结合

使用高盐洗涤剂（PBS 或 TBS 补充有 0.5% NaC1 和 0.2% SDS）

非特异性结合

一抗浓度过高

增加一抗稀释度。

二抗浓度过高

增加二抗稀释度。

抗原浓度过高

减少上样量

小分子蛋白质的检测效果差

小分子蛋白质会被大分子阻挡物（如 BSA 分子）

考虑使用酪蛋白或低分子量聚乙烯吡咯烷酮 （PVP）封闭。

表面活性剂如吐温可能需要尽量减少

避免抗体孵育时间以及洗涤时间过长。