产品货号：CK001

储存条件：CCK-8溶液在避光，0-5℃的条件下可以保存一年； -20℃下保存2年；如需经常使用请将试剂存放在0-5℃，为防止背景值增加干扰实验结果，请勿反复冻融。

CCK-8试剂使用方法

一、通用操作步骤

1. 在96孔板每孔加入100uL细胞悬液； 2.在培养箱中预培养细胞；3.向培养板中加入药物(如果不加药物，直接进行第五步操作)；4.在培养箱中培养一段时间；5. 向每孔加入10 μL的CCK溶液；6. 将培养板在培养箱内孵育1～4小时(根据具体实验优化)。7. 用酶标仪测定在450nm处的吸光度

二、制作标准曲线（测定细胞具体数量时）

1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。

2、按比例(例如:1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。

3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，OD值为纵坐标 (Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间)

三、细胞活性检测

1、在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（在37 °C,5% CO2的条件下）。

2、向每孔加入10 μL的CCK溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。

3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

5、如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。

四、细胞增值-毒性检测

使用方法（以96孔板为例，其他规格培养板按实际情况安排）：

1、在96孔板中配置100μl的细胞悬液（通常细胞增殖实验每孔加入100μl 2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100μl5000个细胞。具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等因素决定）。按照实验需要，进行培养（在37 °C，5%CO2,，的条件下）预培养24小时。

2、向培养板加入1-10μl不同浓度的待测药物刺激。

3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（后面有具体细胞的建议时间，例如：6、12、24或48小时）。

4、每孔加入10μlCCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。如果起始的培养体积为200μl，则需加入20μl CCK-8溶液，其他情况以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测，需设置加了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。

5、在细胞培养箱内继续孵育1-4小时，对于大多数情况孵育1小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定，初次实验时可以在0.5、1、2和4小时候分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。

6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度，如无450nm滤光片，可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长，例如650nm，作为参考波长进行双波长测定。

7、如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。

8、注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

活力计算： 细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100
A（加药）：具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度
A（0加药）：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力 

注意事项：

1、由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发的问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加PBS，水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。

2、CCK-8检测细胞活性的原理是通过检测活细胞脱氢酶催化的反应。任何待测体系中存在还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

3、建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。

4、建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入CCK试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要查到培养基液面下加样，溶液产生气泡，会干扰OD值读数。

5、当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1000个/孔（100μl培养基）。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2500个/孔，（100μl培养基），且培养时间长一些。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

6、加入CCK-8溶液时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色已变化或PH值变化。建议换用新鲜的培养基。

7、如果没有450nm的滤光片，可以使用吸光度在430-490nm之间的滤光片，但是450nm滤光片的检测灵敏度最高。

8、酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

9、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

CCK-8 试剂参考实验数据

（此数据仅供参考，建议预先摸索最佳实验条件）