货号：N3027G

存储温度：4-30℃

概述:

Ni树脂可用于在天然或变性条件下纯化带His标签的融合蛋白。Lablead Ni-TED离心柱的结合能力为每柱≥1 mg，具体取决于目标蛋白大小、结合条件及His标签的可及性。需根据实验优化具体方案。建议先通过SDS-PAGE估算目标His标签蛋白的表达水平。

缓冲液准备:

所用缓冲液需要采用高纯水配制，使用前建议用0.45um滤膜过滤。

平衡缓冲液：0.2M NaCl，50mM Tris-Hcl，0.1mM EDTA，PH=7.4

漂洗缓冲液：0.2M NaCl，50mM Tris-Hcl，0.1mM EDTA，30mM咪唑，PH=7.4

洗脱缓冲液：0.2M NaCl，50mM Tris-Hcl，0.1mM EDTA，500mM咪唑，PH=7.4

快速操作指南：

1. 打开底部堵头，放入收集管，松开顶盖。

2. 800×g离心1分钟，弃去保存液。

3. 加250 μl平衡缓冲液，800×g离心1分钟，弃去液体。

4. 加入≤500 μl样品，轻弹混匀，静置结合2分钟。

5. 800×g离心1分钟，保留流穿液。

6. 将柱转入新的2 ml离心管。

7. 加250 μl漂洗缓冲液，800×g离心1分钟，重复洗涤2次，保留洗涤液。

8. 加200 μl洗脱缓冲液，轻弹混匀。

9. 800×g离心1分钟，保留洗脱液。

10. 重复洗脱一次，收集至新的离心管。

详细操作步骤： 

1.样品制备

①收集细胞：4,000×g离心15分钟，沉淀可-20°C保存或立即处理。

建议：预先称量容器以计算细胞沉淀质量。

②裂解：用裂解缓冲液重悬细胞（约5 ml/g细胞），可通过超声、冻融、高压匀浆等方法裂解。

注：通常实验室常用裂解液配方，尽量避免使用含咪唑的裂解试剂即可。

③澄清裂解液：12,000×g离心15分钟，取上清至新管，保留2 μl用于SDS-PAGE分析。

建议：标准纯化通常使用0.5 ml裂解液上清。

2.离心柱预处理

①打开底部堵头，松开顶盖，放入收集管。

②800×g离心1分钟，弃去保存液。

③加250 μl平衡缓冲液，800×g离心1分钟，弃去液体。

④将柱放入新的2 ml离心管。

3.样品结合

①向柱中加入≤500 μl蛋白样品裂解液上清（体积过大可分次上样）。

②轻弹混匀，静置结合2分钟（延长结合时间可提高得率，但可能增加非特异性结合）。

③800×g离心1分钟，保留流出液。

④将柱转入新的2 ml离心管。

4.柱洗涤

①加250 μl洗涤缓冲液，800×g离心1分钟。

②重复洗涤2次，每次收集流出液至单独离心管。

5.蛋白洗脱

①将柱放入新2 ml离心管，加200 μl洗脱缓冲液，轻弹混匀。

注意：可减至100 μl以提高浓度，但可能降低总产量。

②800×g离心1分钟，收集洗脱液。

③重复洗脱一次（通常两次洗脱可回收>90%蛋白）。

④通过SDS-PAGE分析裂解液、流出液、洗涤液和洗脱液。