一般说明
谷氨酸是两种酸性蛋白原氨基酸之一，也是细胞代谢中的关键分子。由谷氨酸脱氢酶从谷氨酸中合成α-KG是TCA循环中关键的厌氧反应。在人体中，谷氨酸在氨基酸降解和处理过量或废氮中都起着重要作用。在哺乳动物神经系统中，谷氨酸是最丰富的兴奋性神经递质。它被认为与学习和记忆有关，也可能与肌萎缩侧索硬化、自闭症、某些形式的精神发育迟滞、以及阿尔茨海默症等疾病有关。谷氨酸存在于各种食品中，并已用作食品工业中的增味剂。本公司生产的谷氨酸试剂盒是基于谷氨酸脱氢酶催化氧化谷氨酸，其中形成的NADH耦合到甲臜(MTT)发色体上。产物的颜色强度(565nm)与样品中谷氨酸的浓度成正比。96-孔板检测范围为0.05 - 2.5 mM谷氨酸。
应用范围
样品如血清、血浆、组织提取物和食物提取物的谷氨酸浓度。
试剂盒组成与保存
缓冲液 | 10 mL | -20°C保存 |
NAD试剂 | 1.0 mL | -20°C保存 |
酶试剂 | 120 mL | -20°C保存 |
MTT试剂 | 1.5 mL | -20°C保存 |
标准液 | 1.0 mL 100 mM | -20°C保存 |
检测步骤
1. 标准曲线: 将15mL 100 mM标准品与585mL蒸馏水混合制备600mL 2.5 mM的谷氨酸预混液。稀释标准品如下表：
标号 | 预混液 + H2O | 体积 (mL) | 谷氨酸 (mM) |
1 | 100mL + 0mL | 100 | 2.5 |
2 | 80mL + 20mL | 100 | 2.0 |
3 | 60mL + 40mL | 100 | 1.5 |
4 | 40mL + 60mL | 100 | 1.0 |
5 | 30mL + 70mL | 100 | 0.75 |
6 | 20mL + 80mL | 100 | 0.5 |
7 | 10mL + 90mL | 100 | 0.25 |
8 | 0mL + 100mL | 100 | 0 |
分别转移20 mL标准品至透明平底96-孔板的孔内。
样品: 添加20 mL样品到不同的孔内。
注意: 血清和组织提取物样品需样品空白对照。
2. 反应试剂制备: 移液前短暂离心酶试剂管，按每孔 60mL 缓冲液, 1mL酶试剂, 5mL NAD 和 14mL MTT的比例配制足量反应试剂。推荐现用现配。样品空白对照，按60 mL缓冲液, 5mL NAD 和 14mL MTT的比例配制足量对照试剂。
3. 反应: 迅速向每孔添加80mL反应试剂(或对照试剂)，轻敲孔板使其混合均匀。
4. 读取光密度: 在565nm处读取时间为零时(OD0)和在30分钟培养后(OD30)的光密度。
5. 计算: 从标准品和样品的测值OD30中减去OD0。绘制标准曲线。测定斜率(Slope)并计算样品中谷氨酸浓度。注意: 如果样品的DDOD值比2.5 mM 谷氨酸标准品DDOD值高，用水稀释样品并再次检测，结果乘以稀释系数。
总则
1. 该检测是以动力学反应为基础，将加入工作试剂应迅速，混匀动作也应迅速而彻底。推荐使用多通道移液器。
2. 样品制备过程中下列干扰物质应避免: EDTA (>0.5 mM), SDS (>0.2%), 叠氮化钠, NP-40 (>1%) 和 Tween-20 (>1%)。
3. 本产品仅供研究用，使用过程中应严格遵循实验安全措施。
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