有效期1年

一般说明

过氧化氢酶是一种抗氧化酶，其功能是催化过氧化氢(H2O2) 的分解，生成水和氧气。过氧化氢在真核细胞内以多种氧化酶和超氧化歧化酶的副产物形式存在。过氧化氢在细胞内的聚集会引发细胞内DNA，蛋白质和脂质的氧化，从而导致基因突变和细胞死亡。过氧化氢酶可去除细胞内的H2O2，保护活细胞免受氧化损伤，过氧化氢酶在氧化胁迫相关疾病中的作用已得到了广泛研究。本试剂盒使用一种氧化还原显色剂来直接测定过氧化氢酶对H2O2的降解，其在吸光度（570nm）或荧光强度（530/585nm）直接与样品中的过氧化氢酶活性成正比，可高效检测酶活。检测范围：0.2-5 U/L 过氧化氢酶。

适用范围

各种生物样品（如血清、血浆、尿液、细胞组织等）的过氧化氢酶活性。

试剂盒组成和保存

缓冲液：  25 mL                                  -20°C保存

酶试剂：120 µL                                   -20°C保存

显色剂：120 µL                                   -20°C保存

H2O2 溶液: 100 µL 3%                         -20°C保存

对照试剂：8 µL                                    -20°C保存

样品准备:

组织（~10 mg）和细胞（~10⁶）提取物用200 µL 缓冲液匀浆并以14,000rpm的转速离心10分钟制备而成。取上层清液用于检测。

注意：已知含巯基的试剂（如β-巯基乙醇，二硫苏糖醇）可干扰这项检测，因此应确保样品中此类试剂浓度<5 mM。

检测步骤

1. 试剂准备:  将所有试剂放至室温。打开试管前先短暂离心。检测过程中将已解冻的酶试剂始终置于冰上。比色检测使用透明平底96孔板。荧光检测使用黑色96孔板。

样品和对照：将10 µL样品移至96孔板的各个孔内。另外，针对每次检测实验，均需设置空白对照（10 µL缓冲液）。

添加400 µL缓冲液至对照试剂的离心管中混匀。将10 µL混匀后的对照品移入孔板。

注：

（1）对于未知的样品，设置数个稀释梯度以确保过氧化氢酶活性在0.2 ~ 5 U/L的线性检测范围内。（2）试剂盒中的过氧化氢酶是作为阳性对照以确定检测试剂是起作用的，不应用于计算样品中过氧化氢酶活性。

2. 酶试剂

将5 µL 3% H2O2与914 µL H2O混合（最终浓度为4.8 mM）。然后将1µL  4.8mM H2O2和95 µL检测缓冲液混匀，可为每个孔中样品、阳性对照或和空白对照准备充足的50 µM H2O2底物。注：稀释的H2O2是不稳定的，因此最好在每次实验时现用现稀释。取90µL 50 µM 的底物添加至每个孔中，开始过氧化氢酶反应。轻敲平板使其快速混匀。室温培养30 min。此时可继续进行步骤3和4操作。

3. H2O2标准曲线

混合40 µL 4.8 mM H2O2 与440 µL H2O使得H2O2的浓度为400 µM。据下表配置各浓度的H2O2溶液。各取10 µL移入96孔板各孔内，加入90 µL 检测缓冲液。

4. 显色反应

按照下列比例为每个反应孔（样品、阳性对照和H2O2标准液）准备足够的反应试剂，即将102 µL缓冲液、1 µL酶试剂和1 µL显色剂混合。在30分钟培养（步骤2）结束后，向每孔加入100 µL反应试剂。轻轻振荡混匀，继续室温下反应10分钟。

5. 读取570nm波长处的吸光度或l em/exc = 585 nm/530nm下的荧光强度。

浓度计算

从标准品的测值中减去空白对照品的测值（#4），绘制DOD或DF与标准浓度的曲线。测定斜率(Slope)并计算样品中过氧化氢酶活性：

R样本空白 和 R样本分别是样本空白和样本的吸光度或荧光强度读数，n是样品稀释系数。

单位定义

在pH 7.0，25℃，过氧化氢底物浓度50mM条件下，一单位过氧化氢酶每分钟可以分解 1μmol 过氧化氢生成氧气和水。

注意事项：本产品仅供研究用，使用过程中应严格遵循实验安全措施。