产品货号：E6043/E6044/E6045/E6046

储存条件：-20℃避光保存 。 开封后按指定温度保存，可有效放置一年。

产品介绍

细胞增殖检测是评估细胞健康程度、遗传毒性及抗肿瘤药物效果的基础实验手段。检测细胞增殖最精确的方法是BrdU法。EdU法检测试剂盒是BrdU法的革命性突破。EdU（5-乙炔基-2’-脱氧尿苷）是一种嘧啶类似物，在DNA合成期整合入DNA双链。EdU法检测基于“点击”反应，一种由铜催化的叠氮化合物和炔烃作用发生共价反应，形成共价键。本试剂盒中，EdU含有炔烃，YF488/555/594/647AAzide染料含有叠氮化合物。点击法的EdU标记增殖快速有效，易于使用。

BrdU方法需要DNA变性（如酸变性、热变性或者用DNase消化）暴露出BrdU，从而方便BrdU抗体结合；而EdU法只需多聚甲醛固定和TritonX-100促渗就可以使检测试剂进入细胞，只需少量的叠氮化染料即可非常有效地标记出整合的EdU。本试剂盒包含EdU法检测所需要的所有组分，可以用于体外培养细胞的增殖检测。

荧光光谱数据：YF488 Azide：495/519nm；YF 555 Azide：555/565nm；YF594 Azide：590/617nm

YF 647A Azide：650/670nm；Hoechst 33342：350/461nm（boundtoDNA）

产品组分

规格：如果用于荧光显微镜检测，所能使用次数为上述各个规格的最大使用次数（针对96孔板培养的细胞），如E6043/

E6044/E6045/E6046可检测20个孔的样品（不同容器的具体用量可参考附表1）；如果用于流式检测，所能使用次数为上述各个规格的最小使用次数，如E6043/E6044/E6045/E6046可检测2个样品。

使用方法

实验材料（自备）

10 mM PBS, pH 7.2-7.6

4 %多聚甲醛固定液（in PBS）

促渗试剂（0.5 %Triton X-100 in PBS）

2 mg/mL 甘氨酸溶液（in ddH2O） 3 %BSA in PBS, pH 7.2-7.6

1 % BSA in PBS, pH 7.2-7.6

ddH2O

96/24/12/6 孔培养板或培养皿 

荧光显微镜检测方法

1.细胞培养

取对数生长期细胞，以每孔4×10³-1×10⁵细胞（可根据细胞大小、生长速度以及实验处理的具体要求调整细胞数量和密度）接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。

2.药物处理

根据实验需要进行各种药物处理。

3.EdU标记

（1）用细胞完全培养基按一定比例稀释EdU溶液（组分A）至合适浓度后加入细胞中，混匀；设置不加EdU处理的阴性对照组。

注：EdU的标记浓度需根据细胞类型加以调整，建议以10µM的初始浓度进行摸索。预实验中，建议设置EdU浓度梯度,可参考附表2和附表3。

（2）细胞培养箱中孵育2h。

注：最佳孵育时间与细胞周期有关，大多数肿瘤细胞系均可采用2h的孵育时间，可参考表2。Edu浓度与孵育时间相关，短时间孵育（<2h）宜采用高浓度，如：10~50μM；长时间孵育（>24h）宜采用低浓度，如：1~10μM；也可参考表3。

4.细胞固定及促渗

注：对于需要做细胞表面抗原标记的实验，可以考虑在完成EdU孵育后，以含3%BSA洗涤液洗涤细胞2次，在细胞固定促渗之前进行。

（1）孵育完成后，去除培养基。以1XPBS清洗细胞两次，每次5min，以除去未掺入DNA的EdU残留，贴壁不牢的细胞可降低清洗强度。加入50μL4%多聚甲醛固定液，室温孵育20min后，去除固定液。

（2）每孔加入50μL2mg/mL甘氨酸溶液，室温孵育5min，中和残留的固定液。

（3）以每孔100μL3%BSA洗涤细胞2次。

（4）去除洗涤液，加入100μL0.5%TritonX-100，室温孵育10min。

5.EdU检测

注：本参考步骤每个样本使用100μL的工作液，用户可以根据自己的样本情况调整用量。

（1）配置1×Click-iTEdU反应缓冲液（组分C）：用ddH2O将组分C稀释10倍。

（2）配置5×Click-iTEdU缓冲液添加物（组分E）：加300μL的ddH2O至30mg的E组分管中（终浓度100mg/mL），混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在-20℃,可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用。

注：不同规格的组分E均按照此比例加ddH2O溶解，制备成5×储液备用。

（3）准备1×Click-iTEdU缓冲液添加物：用ddH2O稀释5×Click-iTEdU缓冲液添加物至1×,溶液应现配现用。

（4）依据下表准备 Click-iT 工作液。

（5）去除促渗剂，每孔100μL的3%BSA洗涤液洗涤2次。

（6）每孔加入100μLClick-iT工作液，均匀覆盖细胞。

（7）室温避光孵育30min。

（8）除去Click-iT工作液，以100μL3%BSA洗涤细胞2次后，去除洗涤液,加入100μLPBS保持细胞湿润。如其他无特别要求，即可进行拍照分析。

6.DNA复染（可选）

（1）用100μLPBS洗涤细胞1次，去除洗涤液。

（2）用PBS将Hoechst 33342（组分F）稀释2000倍。

（3）每孔加100μL1×Hoechst 33342溶液，室温避光孵育15-30min。

（4）去除Hoechst33342溶液，用100μL PBS洗涤细胞2次。

7.成像及分析

建议染色完成后立即进行荧光显微镜拍照观察；如果条件限制，请于4°C条件下避光湿润保存3天之内完成拍照。

流式细胞仪检测方法

1.  细胞培养

每孔1×10⁵-3×10⁶细胞接种于 6 孔板中。

2.  药物处理

根据实验需要进行各种药物处理。

3. EdU  标记细胞

（1）用细胞完全培养基按一定比例稀释 EdU溶液（组分 A）至合适浓度后加入细胞中，混匀；设置不加 EdU处理的阴性对照组。

注：EdU 的标记浓度需根据细胞类型加以调整，建议以10 µM的初始浓度进行摸索。预实验中，建议设置 EdU 浓度梯度，

可参考附表 2 和附表 3。

（2）细胞培养箱中孵育 2 h。EdU 孵育细胞的时间可以直接用作测定细胞 DNA  合成的指标，时间点选择以及孵育的时间取决于细胞生长速率。通过短暂的 EdU 孵育进行的脉冲式标记细胞可以用于研究细胞周期动力学。

注：最佳孵育时间与细胞周期有关，大多数肿瘤细胞系均可采用2h的孵育时间，可参考附表2。EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育（<2h）宜采用高浓度，如：10~50μM；长时间孵育（>24h）宜采用低浓度，如：1~10μM；也可参考附表3。

4.细胞固定及促渗

注：对于需要做细胞表面抗原标记的实验，可以考虑在完成EdU孵育后，以含1%BSA洗涤细胞2次，在细胞固定促渗之前进行。

（1）孵育完成后，收集细胞，每管加入1mL PBS清洗细胞，1000rpm离心5min，吸弃上清，以除去未掺入DNA的EdU残留。

（2）每管加入1mL4%多聚甲醛固定液重悬细胞。

（3）室温孵育20min，1000rpm离心5min，吸弃上清。

（4）每管加入1mL 2mg/mL甘氨酸孵育5min，中和残留的固定液，1000rpm离心5min，吸弃上清，每管加入1mLPBS清洗1次，1000 rpm离心5min，吸弃上清。

（5）每管加入1mL0.5%TritonX-100促渗液重悬细胞，室温孵育10min。

5.EdU检测

注：针对6孔板样本可参考每孔1mL的工作液来进行，用户可以根据自己的样本情况调整用量。

（1）配置1×Click-iTEdU反应缓冲液：用ddH2O将组分C稀释10倍。

（2）配置5×Click-iTEdU缓冲液添加物（组分E）：加300µLddH2O至30mg的组分E试管中（终浓度100mg/mL），混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在-20℃，可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用。

注：不同规格的组分E均按照此比例加ddH2O溶解为5×储液备用。

（3）准备1×Click-iTEdU缓冲液添加物：以ddH2O稀释5×Click-iTEdU缓冲液添加物储液至1×,溶液应现配现用。

（4）依据下表准备Click-iT工作液。

（5）1000rpm离5min，吸弃上清，去除促渗剂，每管加入1mL的1%BSA洗涤液洗涤2次，1000rpm离5min，吸弃上清。

（6）每管加入1mLClick-iT工作液，混匀。

（7）室温避光孵育30min。

（8）1000rpm离5min，吸弃染色反应液，每管加入1%BSA洗涤细胞2次，1000rpm离心5min，吸弃上清，用1mL1%BSA再次重悬细胞（重悬细胞的溶液体积可根据细胞的数量加以调整），流式细胞仪检测。

注：如需进行其他标志物检测可参考步骤4。

6.DNA复染（可选）

（1）用100μLPBS洗涤细胞1次，去除洗涤液。

（2）用PBS将Hoechst33342（组分F）稀释2000倍。

（3）每孔加100μL1×Hoechst33342溶液，室温避光孵育15-30min。

（4）去除Hoechst33342溶液，用100μLPBS洗涤细胞2次。

7.细胞内抗原标记（可选步骤）

（1）加入抗体工作液，混匀。

（2）避光条件下，以合适的温度及时间孵育抗体。

8.流式检测及分析:

（1）建议染色完成后立即进行流式检测；如果条件限制，请避光4℃湿润保存待测，但不应超过3天。

（2）检测的细胞数量建议尽量能达到百万级，若细胞数量较少，检测的细胞数量可调整为十万级起始进行实验。对于细胞

得率过少（刚到万级）的情况，可能不利于做流式图，对此可适当减少步骤5（8）中的清洗次数。

注意事项

1.使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

2.荧光染料均存在淬灭问题，实验操作时请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。 

3. Click-iT EdU  缓冲液添加物溶液最好现配现用，以保证最佳结果。

4.本品不建议与TUNEL试剂盒同时检测，由于Edu的结构中有-OH存在，会影响TUNEL的反应过程。

附录

表1  EdU培养基及染色反应液的参考用量

表2  EdU的参考孵育时间

表3  文献中 EdU 孵育浓度及时间