货号：GNA/MNA/RNA/HNA/FNA/BNA/VNA/TNA
储存条件：短期使用可4℃保存。长期-20℃保存 有效期 2 年(确保完全密封)，避免反复冻融。
产品描述
偶联anti-GFP/Myc/RFP/HA/DYKDDDDK/MBP/V5/GST纳米抗体的琼脂糖珠子用于免疫沉淀GFP/Myc/RFP/HA/DYKDDDDK/MBP/V5/GST等融合蛋白。
产品优势
没有普通抗体的轻链和重链；
高亲和力：解离常数达到pM级别；
高载量：10μl的beads可以结合8-12μg 蛋白（V5标签载量为6-8ug）；
较短的孵育时间，结合5-30min即可；
应用范围
可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色质免疫沉淀（ChIP）/RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）、酶活性测定、质谱分析等；
特异性
GFP款可以结合GFP、EGFP、YFP和EYFP等；RFP可结合mCherry。
产品特性
存储缓冲液：PBS(含有20%乙醇)。
实验步骤：
植物组织裂解处理：
取适量植物组织样本（叶片等）放置于冷冻液氮中，之后将冷冻后得植物组织样本放于研钵进行研磨，尽可能充分研磨破坏其细胞壁。加入500-1000ul RIPA 裂解液（需加蛋白酶抑制剂）进行裂解，为了提高裂解效率，可加入200ul 玻璃粉充分震荡 30min，裂解完成后12000 rpm，离心30min，吸取上清置新的离心管中，弃去沉淀。
收集细胞：
每个免疫沉淀反应大约使用 106-107 个表达融合蛋白的细胞，可根据绿色荧光蛋白融合蛋白表达量适当调整细胞数。吸出培养基，向培养皿中加入预冷的1×PBS，漂洗2次，利用细胞刮或胰酶消化收集贴壁细胞，细胞转移到离心管，500g离心3分钟并丢弃上清液。
动物细胞裂解：
1．在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，用500μl预冷的裂解缓冲液重悬细胞。
2．置于冰上30分钟，可每10分钟充分吹打一次。
3．4℃，20,000g离心15分钟，将裂解产物（上清）转移到一个新的预冷管中，丢弃沉淀。注意：此时细胞裂解产物可长期保存于-80℃。
平衡珠子：
4．振荡充分混匀GFP/Myc/RFP/HA/DYKDDDDK/MBP/V5/GST-Nanoab-Agarose，吸取20μl该产品到500 μl预冷的裂解缓冲液中，4℃，2,500g离心2分钟，丢弃上清液。（此步骤可选）
结合蛋白：
5．将平衡好的GFP/Myc/RFP/HA/DYKDDDDK/MBP/V5/GST-Nanoab-Agarose加入到细胞裂解产物中（如果未做第4步，可在细胞裂解产物中直接加入20μl该产品），于4℃旋转混合结合30-60min。如果需要，留存50μl的裂解产物进行免疫印迹分析。
注：不建议过夜孵育
6．4℃，2,500g离心2分钟，丢弃上清液。如果需要，留存50μl上清液进行免疫印迹分析。
清洗珠子：
7．用500μl预冷的裂解缓冲液中重悬6中的GFP/Myc/RFP/HA/DYKDDDDK/MBP/V5/GST-Nanoab-Agarose，4℃，2,500g条件下离心2分钟，丢弃上清液并重复洗涤2次。
洗脱蛋白：
方法一：
8．加入20μl 2×SDS-sample buffer重悬GFP/Myc/RFP/HA/DYKDDDDK/MBP/V5-Nanoab-Agarose。95℃，加热10min，2,500g离心2分钟收集上清，收集的产物可进行SDS-PAGE及免疫印迹分析。
方法二：
9．替代步骤8的可选步骤：加入50μl 0.2 M pH2.5的甘氨酸洗脱结合的蛋白，孵育时间30秒，期间不断混匀，2,500g离心2分钟收集上清，为了中和酸性的甘氨酸，需加入5μl 1.0 M Tris（pH10.4）。
注意：为了提高洗脱效率可以重复这一步。
可选方案
方案一：
如需进行GFP/Myc/RFP/HA/DYKDDDDK/MBP/V5融合酶的活性检测，无需洗脱，可以直接检测。
方案二：
如需进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验，主要用于含有GFP融合蛋白的蛋白质/DNA相互作用的实验。染色质免疫沉淀一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化以及DNA的鉴定。其中前期细胞固定，染色质断裂不变；然后接着直接进入说明书的第5步，加入细胞裂解产物后，DNA-蛋白质复合物结合到GFP/Myc/RFP/HA/DYKDDDDK/MBP/V5/GST-Nanoab-Agarose上；
进入第6和7步，分离得到复合物；进入第10步，得到洗脱的复合物；后期交联反应的逆转，DNA的纯化及DNA的鉴定等同于普通的ChIP实验。RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验步骤同上。
方案三：
GFP/Myc/RFP/HA/DYKDDDDK/MBP/V5/GST-Nanoab-Agarose不仅可以用于在体内外检测和验证蛋白质之间的相互作用， 也可以结合质谱分析筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步骤同免疫沉淀法，得到洗脱的复合物后，然后进行SDS–PAGE分析，用考马斯亮蓝或者银染的方法染色后，切下未知蛋白的条带，用质谱技术鉴定未知蛋白。
免疫沉淀常见问题
一、 对应标签的衍生物是否可以识别？
GFP: GFP、EGFP、YFP 和 EYFP 等
RFP: RFP/mcherry
MYC: 识别位于融合蛋白N-端、C-端及内部的Myc-tag。不结合内源性c-Myc
二、 是否会出现轻重链污染的情况呢？
我们LABLEAD的beads是基于纳米抗体（为IgG抗体的重链可变区，大小只有15KD）制成的，一般用传统的抗体会出现轻重链污染是由于传统抗体变性沉淀后会出现的重链（50kDa）和轻链（25kDa）两条带，导致结果受到影响，而我们的纳米抗体大小只有15KD，特异性高，不会出现这种污染的情况。
三、如何选择beads的类型，是选择磁珠的，还是琼脂糖的呢？
选琼脂糖珠或者磁珠都可以得到较好的结果，只是在操作上有一些细微差别（请参照说明书），相对来说琼脂糖的更便宜些，如果是大量样本可以选择琼脂糖珠的。
四、应该选择哪种洗脱方式？
1、变性洗脱：添加loading buffer后煮沸，再进行电泳或者WB检测
2、酸洗脱（非变性）：利用0.2M 甘氨酸洗脱，洗脱后添加pH10.0 的tris进行中和，目前已验证我们的beads可以不进行后续的中和步骤，客户可以用PBS多清洗几次后就可以重复使用了
3、多肽洗脱（非变性）：利用标签蛋白相同的多肽进行竞争洗脱
以上三种方式，客户只做检测不回收beads推荐用方式1；
需要重复使用beads 或者保持蛋白活性，推荐用方式 2或者3；
免疫沉淀试剂盒中含有的洗脱液E组分为
多肽洗脱产品：F1001（flag）
五、没有目的条带、条带弱
1..蛋白表达量太低或降解
内源表达低，裂解时被蛋白酶降解，可以加蛋白酶抑制剂，提高上样量，缩短处理时间。
2.抗体不合适
用了不识别天然构象的抗体（只识别变性抗原）；
抗体效价低、种属不匹配，建议客户换IP 级 / 天然构象抗体，同时看阳性对照的结果
3.洗涤过强
高盐、高去垢剂把结合蛋白洗掉，建议→ 减少洗涤次数，降低洗涤液盐浓度
六、非特异性条带多/背景高
1.减少beads量
2.缩短孵育时间
3.裂解液和漂洗液中加5-10%甘油或1%的triton X-100
七、input有条带，IP没有条带/没有检测到目的蛋白
1.样本中目的蛋白不表达或低水平表达，如果表达水平低，需要增加裂解液用量，但也可能导致非特异结合的增加，所以在免疫沉淀之前需要预先清除裂解液。
2.beads用量不够，检查beads用量，提高使用量。
3.目标蛋白没有从磁珠上洗脱，需要确保使用的洗脱缓冲液正确。
4.裂解液中盐碱度太高，需要改用低盐碱度裂解液。一般可选NP-40，RIPA，western及IP细胞裂解液。
八、再生
Flag抗DYKDDDDK beads的再生：
抗DYKDDDDK beads可以多次重复使用，以纯化flag标签不同融合蛋白
若在一段时间内纯化同一蛋白，则无需再生。
再生步骤：
1. 用2个体积的0.1M Tris-HCl、0.5M NaCl、pH 12.0溶液洗涤beads。
2.用3-5体积的TBS或者PBS重新平衡beads。
3.对于短期储存，beads可以在2-8°C下储存在含有0.02%叠氮化钠的TBS或PBS中，或者储存在含有50%甘油和0.02%叠氮化钠的TBS或PBS中，温度为-20°C。Beads可以循环使用至少4次。如果维护得当，结合能力损失最小。
九、proteinA/G常见问题
1. 抗体的选择
IP 抗体：尽量选择可用于IP的抗体，一般IP抗体识别的蛋白质三级空间结构的位点，而WB抗体只需识别线性结构位点，当说明书未表明能做IP时优先选能做免疫组化或免疫荧光的抗体
WB一抗：选择与IP抗体来源不同的抗体可避免轻重链污染
2.轻重链污染的原因？如何避免轻重链污染？
原因：WB检测的二抗与IP时的抗体结合导致曝光出条带（大约在25KD、55KD）
解决方案：
在IP洗脱方式采用酸洗脱；
IP抗体和WB一抗选用不同来源的；
IP抗体用纳米抗体形式。
3.无信号
a.蛋白未表达或者表达量很低
确定蛋白是否表达以及表达量，增加样本量并进行预处理
b.裂解不充分导致蛋白未释放
更换合适的裂解液或优化裂解配方
c.抗体失效
确认抗体效期、通过WB来验证抗体效果
d.蛋白未被洗脱
调整洗脱液的pH或者浓度
e.抗体与珠子未结合
更换合适的珠子
4.背景深
a.蛋白样品中可能有不容易溶解的大蛋白复合物等
样本裂解后超声处理（参考条件：5s，3次）
添加Dnase I 降解基因组（可能是强效裂解液导致基因组释放）
b.抗体特异性不好
更换抗体，尽量选择单克隆抗体
c.IP抗体的量太多
优化条件
d.目的蛋白可能降解了
样本中及时添加蛋白酶抑制剂
使用新提的样本
e.样本量多导致的蛋白沉beads
增加洗杂缓冲液盐浓度
漂洗液中添加5%甘油或0.1% Triton X-100
优化样本量，建议使用100-500ug细胞裂解样本
5.igg阴性对照有条带
a. beads先连抗体再连蛋白
b. 用高盐的漂洗液，增加漂洗次数。
c. beads连抗体之前封闭30min-1h
