Cy3,SE

货号：C1051

存储条件：-20℃干燥避光保存，有效期一年。

产品简介

菁染料是性能优良的荧光标记染料，摩尔吸光系数在荧光染料中是最高的，其琥珀酰亚胺酯是最常用的脂肪氨基标记试剂，广泛用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测。通过改变次甲基链的长度, 可改变其荧光发射波长，每增加一个双键，按照Huoffman规则正好红移约100nm。

菁染料Cy3和Cy5已成为基因芯片的首选荧光标记物；另外，Cy5, Cy5.5和Cy7的吸收在近红外区背景非常低，是荧光强度最高、最稳定的长波长染料。特别适合于活体小动物体内成像代替放射性元素

菁染料琥珀酰亚胺酯（CyDye NHS）的标记

菁染料和生物分子的比例F/P=4～12之间荧光强度最高，F/P值过高荧光探针会自我淬灭并影响生物分子的生物活性，标记生物分子最好是用单琥珀酰亚胺酯，但是用双修饰的CyDye NHS并没有发现交联。CyDye NHS标记抗体在pH (8.5～9.4)时10分钟F/P可达5～6，而在pH 7.0几乎不反应。我们用不同比例的Cy3标记anti-glutathione-S-transferase (GST)多克隆抗体发现用1:1, 5:1, 10:1 和20:1标记时得到的F/P值分别是0.28:1, 1.16:1, 2.3:1 和4.6:1。      

操作步骤

1.水溶性Cy3 NHS标记anti-GST多克隆抗体

市场上买到的抗体如果含有其它蛋白（例如serum albumin或gelatin等）或带氨基的缓冲液会影响标记，在标记前需纯化。

1）在1L 0.15M NaCl溶液中透析anti-GST抗体(浓度为0.5mL at 3mg/mL)，常温透析4小时。

2）在4°C用新鲜的1L 0.15M NaCl溶液再透析过夜。

3）第二天用1L 0.1M NaHCO3(pH 8.3)透析4小时。

4）用0.22μm注射器过滤头过滤抗体溶液。

5）用0.1 M NaHCO3稀释少量的抗体，在280nm处测其紫外吸收值计算标记抗体的总量（IgG antibody摩尔吸光系数170 000 M^-1cm^-1at 280nm).

6）用DMSO配置Cy3 NHS (MW765.95)溶液浓度为10 mg/mL；计算所需体积以得到想要的CyDye NHS和抗体的比值(例如20:1)，然后慢慢将其加入到抗体溶液中，同时在暗处常温缓慢搅拌45分钟。

7）用1L 0.15M NaCl 溶液常温避光透析4小时除去未标记上的Cy3。

8）在4°C用新鲜的1L 0.15M NaCl 溶液再避光透析过夜。

9）用1L of 0.01 PBS/0.01% 叠氮化钠溶液常温避光透析4小时, 在4°C常温避光再次透析过夜。

10）用0.22 μm注射器过滤头过滤抗体溶液。

11）用0.01 M PBS/0.01 %叠氮化钠整数倍稀释标记抗体溶液，测量280nm（蛋白）和552nm（Cy）处的紫外可见吸光度。

12）产品冷冻干燥成粉末或在0.01 M PBS/ 0.01% 叠氮化钠溶液中，-20℃避光储存。

2.F/P计算：

Cy3在552nm摩尔吸光系数为150 000 M^-1cm^-1；此蛋白在280nm的摩尔吸光系数为170 000 M^-1cm^-1；不同蛋白的摩尔吸光系数不一样；.Cy3染料本身在280nm的吸收是552nm处的8%。

按以下公式计算F/P值:

[Cy3] = A552/150000

[antibody] = {A280- (0.08×A552)}/170000

F/P final= [Cy3]/[antibody]= {1.13×A552}/ {A280- (0.08×A552)}

产品参数