货号：D0206P

存储温度：-20°C，有效期2年

产品组分

产品简介

基于重组原理的无缝克隆技术，作为新一代的克隆方法，不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平等操作，依据DNA片段与线性化载体末端的15~25nt同源序列的重组，可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点，载体自连背景极低，是一种简单、快速、高效的DNA定向克隆技术。

DNA Assembly Mix Promax无缝克隆试剂盒单次反应可完成1~15个片段的组装，最快仅需1min 即可完成单片段重组，阳性率高达95%。通过优化缓冲液组分与酶的配比，DNA Assembly Mix Promax与DNA Assembly Mix ultra相比显著提升了对未纯化PCR产物的耐受性及产品稳定性，无惧氧化、冻融影响。此外，DNA Assembly Mix Promax 与 DNA Assembly Mix Ultra 同样使用HiFi Taq DNA Ligase，连接保真度高。

实验步骤

1、实验流程概要

2. 线性化克隆载体制备

选择合适的克隆位点，对载体进行线性化，载体的线性化可以通过酶切或反向 PCR 扩增完成。

① 酶切制备

推荐使用LabFD™快速内切酶进行双酶切，使载体线性化完全，以降低转化背景(假阳性克隆)；若使用单酶切进行线性化，可以适当延长酶切时间以减少环状质粒残留。

注：1. 经双酶切进行线性化的载体无需去磷酸化，单酶切则需要去磷酸化；

2. 酶切完成后，应将载体进行纯化方可进行重组反应，未纯化的酶切产物会抑制转化。

3. 载体胶回收时建议长时间电泳与残留的环状质粒区分开后再切胶，以减少假阳性率。

② 反向 PCR 扩增制备

为减少扩增突变的引入，推荐使用高保真PCR Mix进行扩增。推荐使用预线性化质粒作为模板，以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。

注：1. 使用环状且Dam⁺的质粒作为模板时，若PCR产物无非特异性条带，强烈建议使用LabFD Dpnl(货号:F5585SS) 1 ul加入50 ul PCR产物中37°C 1h,65°C 5min消化质粒模板，以减少假阳性。Dpnl消化后的PCR产物可不纯化使用，加入体积不超过反应体积的20%，但重组效率会降低，推荐纯化后进行重组。

2.  3片段以上克隆或PCR产物有非特异性带时，需将PCR产物纯化后使用。

3. 插入片段PCR引物设计

PCR引物的5' 端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端同源的15~25 nt（推荐18nt）序列。假如载体为粘性末端，且3'端突出，则引物设计必须包含突出部分；若5'端突出，则引物设计可以包含突出部分，也可以不包含。

插入片段正向扩增引物：

5'—上游载体末端同源序列+酶切位点（可选）+ 基因特异性正向扩增序列— 3'

插入片段反向扩增引物：

3'—基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可选）+下游载体末端同源序列—5'

注1. 尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆，当载体克隆位点上下游25 nt区域内GC含量为40%~60%时，重组效率最高； 

2. 当重组转化子产物>10kb以上时，推荐按20~25bp同源臂设计引物。

3. 如果最终引物长度超过40bp，推荐在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。

4：本试剂盒所提供的 pUC 19 载体（Amp^r）连接端序列如下：

4. 插入片段的 PCR 扩增

推荐使用高保真PCR Mix进行扩增，以减少扩增突变的引入。建议使用纯化后的PCR产物进行无缝克隆反应，若PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物且无引物二聚体，可直接使用，但片段数量超过3个或组装长度超过5 kb的片段时强烈建议纯化后使用，以保证成功率。

5. 重组反应

① 于冰水浴中配置以下反应体系：

a. 最适载体用量(ng)=0.02×载体碱基对数，即0.03pmol。

b. 插入单片段，最适片段用量（ng）= 0.04×片段碱基对数。插入多片段，每片段最适用量（ng）= 0.02 ×片段碱基对数。

c. 阴性对照1可用来确认线性化载体中是否有环状质粒残留，使用首次回收的线性化载体时强烈建议设置，确认无载体背景后可不再设置。 

d. 阴性对照2当插入片段扩增模板是与克隆载体抗性相同的环状质粒时，推荐进行。建议将线性化载体与插入片段的环状质粒残留检测独立进行。

e. 阳性对照可用来排除其它实验材料及操作因素的影响。

注：

1. 若插入单片段的长度大于载体，则应互换载体与插入片段用量；

2. 若插入片段的长度小于200 bp，则插入片段应使用5倍载体用量；

3. 若按上述公式计算得到的用量超过最低/最高值，则建议直接按最低/最高用量使用；

4. 载体用量允许范围为0.006~0.15 pmol；

5. 片段载体摩尔比应控制在10以内；

6. 载体片段过长、插入片段过长或片段数过多，克隆菌落数及阳性率均会降低。

7. 单点突变按照最适载体用量加入体系，多点突变按照多片段每片段最适用量加入体系。

重组反应体系配制完成后，用移液枪轻轻吸打混匀各组分，避免产生气泡，切勿涡旋。

② 将反应体系置于50℃，反应5~60min。

注

1. 推荐使用 PCR 仪等温控比较精准的仪器进行反应，反应时间不足或太长克隆效率均会降低；

2. 插入1-2个片段时，推荐反应时间5-15min，，追求超快速连接时可缩短至1~5 min，但菌落数可能有所下降；插入3~5片段，推荐时间15~30 min；插入6~10片段，推荐时间30~60 min；

3. 50℃反应完成后，建议进行瞬时离心，将反应液收集至管底。

③ 将反应液离心管置于冰上冷却，之后进行转化或者储存于-20℃。

注

1. -20℃储存的重组产物，建议在 1 周内使用。

2. 连接产物无法短时间内进行转化时，可在冰上或4℃放置1~4 h，连接效率不受影响。

6. 重组产物转化

取5~10μl反应液，加入到100 μl感受态细胞中缓慢吸打混匀，冰上放置30min。42℃热激60s，冰浴5 min。加500 μl SOC或LB培养基，37℃振荡培养50~60min（200 rpm）。将菌液均匀涂布在含有对应抗生素的平板上，倒置于37℃过夜培养。

注1. 不同感受态细胞最后的克隆阳性率会有所差别，推荐使用转化效率>108 CFU/μg的感受态细胞；

2. 菌落数取决于PCR产物与线性化载体的数量和纯度；

3. 阳性对照平板通常生长大量白色单菌落，阴性对照平板只生长很少的菌落。

7. 阳性克隆检测

挑取单菌落至10 μl ddH2O中混匀，95℃裂解10 min 后，取1 μl裂解液作为模板，进行菌落PCR鉴定，或将单菌落接种至抗性培养基中培养过夜后，提取质粒进行酶切鉴定。

阳性对照的阳性克隆检测，菌落PCR引物使用通用引物M13F与M13R，酶切鉴定用HindIII与EcoRI。

注 1. 菌落 PCR 时建议至少使用一条通用引物，避免假阳性结果；

2. 必要时可进一步对阳性结果进行测序鉴定。

3. M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

   M13R：CAGGAAACAGCTATGAC

FAQs

1. 片段载体摩尔比必须是2:1吗?

片段载体摩尔比通常可在1:1~5:1之间进行设置，推荐2:1。片段载体摩尔比过大时反而会降低连接效率，比例越大，降低越严重。对于常规单片段，片段:载体=20:1时连接效率约为2:1时的20%，片段越多，连接效率下降幅度越显著。

2. 片段、载体都必须纯化吗?

为保证最佳效果，建议片段进行杜回收，载体进行胶回收。若片段扩增特异性好且扩增产量较高时，对于3片段及以下的连接，可不回收。若载体使用酶切获得，建议回收，以避免酶切缓冲液对转化过程的抑制;若载体使用PCR获得，在扩增特异性好且使用Dpnl进行模板消化后可不回收，否则需回收。

3. DNA Assembly Mix Promax允许组装的片段数是多少?

DNA Assembly Mix Promax单次反应最多可组装15个片段，但为，但为保证成功率，建议单次组装片段数量不超过5个，超过时建议进行分步组装。

4. DNA Assembly Mix Promax允许组装的最大片段是多少?

目前 DNA Assembly Mix Promax 已测试可高效组装全长20kb的重组质粒，更长场景暂无测试数据。

5. DNA Assembly Mix Promax 能够组装≤200 bp 的 DNA 片段吗?

可以。当片段大小≤200bp时，为达到更好的组装效果，推荐插入片段的摩尔使用量为载体的5~20倍。 

6. 反应可以在其他温度下进行吗?

最佳反应温度为50°C，在30~60°C范围内也能工作，但效率可能有所下降。

7. 可以用 DNA Assembly Mix Promax 的连接产物作为模板进行PCR或RCA吗?

可以。组装好的产物是完整的环状序列，可以用于后续的PCR或RCA。

8. 单链DNA寡核苷酸片段可以组合在一起，然后与双链DNA片段进行组装吗?

可以。但需要确定每种寡核苷酸的最佳浓度，建议使用45nM作为初始浓度进行摸索；同时，寡核苷酸数量不应超过12种，且彼此之问要有至少30个碱基的overlaps。

9. DNA Assembly Mix Promax 可以组装含5'和3'末端的不匹配序列的插入片段吗?

可以，DNA Assembly Mix Promax 允许5和3'末端同源臂外有530 bp的不匹配序列，超过此长度时连接效率显著下降。若要组装有更长的不匹配序列的片段，建议使用DNA Assembly Mix UItra (REF:D0204P)，其可以组装5'和3末端同源臂外有≤110 bp 不匹配序列的片段。

10. DNA Assembly Mix Promax连接产物可以用于电转化吗?

可以，但需要使用纯化的片段载体进行连接，未纯化片段或载体引入的PCR缓冲液或酶切缓冲液会严重降低电转化效率。电转化可以将转化效率提高几个数量级，通常取1uI连接产物用于电转化即可。

11. 制备片段和载体时可以用TE进行洗脱和储存吗?

可以，TE不影响连接效率。

12. 不小心将DNA Assembly Mix Promax室温放置后能继续使用吗?

DNA Assembly Mix Promax经过特殊优化，37°C储存16天无活性下降，故短时间室温放置不影响活性。但长期储存需在-20°C条件下。

13. DNA Assembly Mix Promax 能用于组装反向重复序列和串联重复序列吗?

不建议，此类序列使用基于Gibson Assembly原理的产品进行组装时容易产生错配或丢失，建议使用 Golden Gate Kit 进行组装。