货号：B0013
存储条件：-20℃保存，组分A需避光，避免反复冻融。
产品组分：
组分 | 20T | 50T |
A. YF®488 TUNEL Reaction Buffer | 1 mL | 2×1.25mL |
B. TdT Enzyme | 20 μL | 50 μL |
C. DNase I (2 U/μL) | 5 μL | 13 μL |
D. 10 × DNase I Buffer | 100 μL | 260 μL |
产品介绍
细胞发生凋亡时, 会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA，产生180 bp-200 bp的 DNA 片段，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现的特异的梯状Ladder图谱。基因组DNA双链或单链断裂时会出现产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的催化作用下，与YF® -dUTP结合，从而通过荧光显微镜或流式细胞仪直接进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal - deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。Tunel法可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中广泛采用。本试剂盒应用范围广，可检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。可选择性的检测凋亡细胞，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。本试剂盒检测细胞凋亡，耗时短，只需一步染色反应，洗涤后即可检测。
使用方法
实验材料（自备）
PBS 缓冲液（1x，pH~7.4）
0.2% Triton X-100（PBS配制）
0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5 mg/mL BSA）
4% 多聚甲醛（PBS 配制）
ddH2O
实验设计
A. 阳性对照：
DNase I处理制备阳性对照。DNase I可以消化单链或双链DNA暴露3'-OH末端，人为造成细胞凋亡。每次实验做一次即可。（用来验证本次实验操作和试剂盒有无问题）
B. 阴性对照：
使用不含TdT Enzyme的TUNEL Reaction Buffer，用ddH2O替代TdT Enzyme。（主要是排除细胞自身凋亡、操作过程等原因导致的非特异性染色；以及调整拍摄曝光强度。）
C. 实验处理组。
实验组按照说明书正常操作。
D. 实验对照组。
实验组按照说明书正常操作。
实验步骤
1. 样本准备：
(1) 对于贴壁细胞
a. PBS清洗1次。
b. 固定：加入适量4%多聚甲醛（PBS配制），4℃固定30 min。PBS清洗2次。
c. 通透：加入适量0.2% Triton X-100（PBS配制），室温通透20 min。PBS清洗2次。
d. 转步骤2. TUNEL 反应。
(2) 对于悬浮细胞或细胞悬液
a. 收集细胞（3-5×106个细胞），1000 rpm离心5 min，PBS清洗2次。
b. 固定：加入适量4%多聚甲醛（PBS配制）充分重悬细胞，4℃固定30 min。2000 rpm离心5 min，PBS清洗2次。
c. 通透：加入适量0.2% Triton X-100（PBS配制），
室温通透20 min。2000 rpm离心5 min，PBS清洗2次。
d. 转步骤2. TUNEL 反应。
(3) 阳性处理（仅阳性对照进行此步骤，其他样品直接进行TUNEL反应步骤）
a. 按1: 10的比例用ddH2O将10× DNase I Buffer稀释成1× DNase I Buffer备用。
b. 滴加100 µL 1× DNase I Buffer到已处理的样本上，覆盖全部样本区域，室温平衡5 min。
c. 用1× DNase I Buffer以1: 100稀释DNase I (2 U/μL)至终浓度20 U/mL的工作液。
d. 弃去Buffer，加入100 μL浓度为20 U/mL的 DNase I工作液，室温孵育10 min。
e. 弃去DNase I工作液，PBS清洗2次。
f. 转步骤2. TUNEL 反应。
2. TUNEL 反应
(1) 配制TUNEL反应液（即用即配）：
工作液配方 | 1个样本 | 5个样本 | 10个样本 |
TdT酶 | 1 μL | 5 μL | 10 μL |
YF®488 TUNEL Reaction Buffer | 49 μL | 245 μL | 490 μL |
TUNEL反应液总体积 | 50 μL | 250 μL | 500 μL |
(2) 对于贴壁细胞
a. 每个样本加入50 μL TUNEL反应液，使反应液均匀覆盖样本。37℃避光孵育适宜的时间（细胞推荐染色时间30 min-1 h）。
注：50 μL TUNEL反应液适合96孔板（其他不同孔板可以适当调整TUNEL反应液体积，覆盖细胞即可）。如果待检测的样品在24孔板、12孔板或6孔板中，可以使用防蒸发膜，或自行尝试使用自封袋或者其它适当材料自行裁剪成比孔略小的圆形塑料片，滴加TUNEL反应液后覆盖在样品上，可以防止TUNEL反应液蒸发，并且使TUNEL反应液均匀覆盖样本。
b. 弃去TUNEL 反应液，PBS清洗2次后，再用0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5 mg/mL BSA）清洗3次，每次 5 min，这样游离的未反应的标记物可以清除较干净。
c. （可选）每个样本加入适量浓度为5 μg/mL 的DAPI染液，室温避光孵育5 min。染色完成后，弃去DAPI染液，PBS清洗2次，每次5 min。
d. 向样本区域加100 μL PBS保持样本湿润，立即在荧光显微镜下观察。
(3) 对于悬浮细胞或细胞悬液
a. 每个样本管加入50 μL TUNEL反应液轻轻重悬细胞，37℃避光孵育30 min~1 h。每隔15 min用微量移液器轻轻重悬细胞。
b. 2000 rpm 离心5 min，弃去TUNEL 反应液，用0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5 mg/mL BSA）清洗2次，每次 5 min，这样游离的未反应的标记物可以清除较干净。
c. （可选）每个样本管加入100 μL浓度为5 μg/mL的DAPI染液，室温避光孵育5 min。
d. 加入400 μL PBS重悬细胞，立即用流式细胞仪检测或进行涂片后在荧光显微镜下观察。
注意事项
1. 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。染色背景较重或非特异性着色明显时可适当减少染色时间。
2. 实验时建议增加阴性对照和阳性对照组。
3. 组分A使用时请佩戴口罩、手套，如接触皮肤，请立即用大量水冲洗。
4. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
6. 本产品只适用于细胞样本染色，若您检测的样本为切片可选择通用型 Tunel试剂盒。
说明书下载
常见问题解答：
为什么没有染上荧光？
1. 固定不充分。固定液首选4%多聚甲醛，现用现配。不建议使用乙醇，乙醇固定液对组织的渗透力较弱，影响TUNEL标记效率.
2. 细胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到达核内。细胞与冰冻切片，可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蜡切片推荐使用蛋白酶K，37℃通透30 min；不同的细胞和组织所需要的通透时间略有不同，时间太长容易脱片，适当调整。
3. 延长标记时间至2h，并适当增加TdT酶及dUTP的用量。
4. 确定实验对象细胞有凋亡。准备一份DNase I处理的阳性对照，验证TdT酶反应是否正确进行。
为什么荧光背景高？
1. 支原体污染：可以使用支原体染色检测试剂盒验证。
2. TdT 酶反应时间过长，可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液将TdT酶稀释2-5倍后再按照说明书操作，稀释后的TdT酶仅供当日使用。
3. 处于高速分裂和增殖状态中的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA 断裂。建议：在非高增殖期取样检测；
4. 有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。
5. DAB 孵育时间过长，减少DAB 染色时间。
6. Biotin-X-dUTP 的非特异性结合，在TdT 酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。
在蛋白酶K中消化组织样品多久？
大部分组织样品需要充分消化15分钟。最佳的培养时间根据组织类型和厚度而不同。脑组织比其他组织需要更长的蛋白酶处理时间。
实验的组织切片应该多厚？
老鼠肠、肾脏、肝脏、心脏和结肠厚度5–20 µm。
