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产品组成

产品简介

Alkaline Phosphatase(Fast)可催化DNA、RNA 以及核苷酸5'端和3'端磷酸基团的水解，也能够去除蛋白磷酸基团，但不能催化磷酸二脂及磷酸三脂的水解。在37℃的条件下作用10分钟，该酶即可使所有类型DNA的末端去磷酸化。由于该酶在LabFD™酶切 Buffer中具有100%活性，且失活条件为80℃温育20分钟，因此与LabFD™快速内切酶进行“酶切-去磷酸化”反应时，可在同管内完成，大大简化了实验流程。

酶活单位定义

37℃条件下，Alkaline Phosphatase缓冲液环境中，10 min内能够1μg线性化pUC57 DNA的5'末端去磷酸化所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。

质量控制

核酸内切酶残留检测

将酶液与超螺旋质粒DNA在37℃温育4h，通过DNA电泳检测质粒无变化。

核酸外切酶残留检测

将酶液与双链DNA底物在37℃温育16h，通过DNA电泳检测双链DNA底物无变化。

宿主检测

将酶液与残留的核酸经E.coli 16S rDNA特异性的TaqManqPCR检测，E.coli基因组残留低于10拷贝。

使用方法

1、质粒载体线性化与去磷酸化同步反应流程

1）于冰上配制如下反应体系：

2）为了保证去磷酸化的效率，质粒DNA应不含RNA和基因组DNA污染。

3）充分混匀并瞬离，37℃温育 15~30 min。

注：如果延长温育时间，可能产生星号活性。

4）80℃温育20min，以终止反应。

2.核苷酸去磷酸化的实验流程

该方案适用于去除 DNA 的3'和5'端磷酸基团。

1）于冰上配制如下反应体系：

2）充分混匀并瞬离，37℃温育 10 min。

3）80℃温育 20 min，以终止反应。

3.蛋白质去磷酸基团的实验流程

1）于冰上配制如下反应体系：

2）充分混匀并瞬离，37℃温育1h；

3）添加EDTA至50mM的终浓度，或添加钒酸钠（Na3VO4）至10mM的终浓度，已终止反应。

注：以上为蛋白质去磷酸基团的反应体系和实验流程的举例，实验时请根据具体底物类型调整 Alkaline Phosphatase 的使用量以及最佳温育时间。

注意事项：

与Alkaline Phosphatase(Fast)结合的DNA在琼脂糖凝胶中可能会出现条带偏移或弥散，为避免出现此现象，可在样品中加入混有SDS的6xLoading Buffer,先在80℃温育20min，冰浴降温后再进行电泳。