货号：P1051-5ml
储存条件：4ºC保存，至少一年有效。除Glutathione Beads 4FF外，其余均可以-20ºC保存。
产品简介：
LABLEAD的GST标签蛋白纯化试剂盒(GST-tag Protein Purification Kit)，是一种简单、快速、高效并且高特异性地纯化GST标签蛋白的试剂盒。试剂盒提供了GST标签蛋白纯化所需的相关试剂和亲和层析柱空柱管，为GST标签蛋白的纯化带来了极大的便利。
本试剂盒可用于大肠杆菌表达的GST标签重组蛋白的纯化，也可以用于哺乳动物细胞、昆虫细胞及杆状病毒等其它表达系统中表达的GST标签重组蛋白。
GST标签重组蛋白在大肠杆菌中表达时具有可溶性高，并且容易保持目的蛋白完整活性等优点。许多真核蛋白在大肠杆菌中是以包涵体的形式表达的，但当它们在大肠杆菌中与GST融合表达时，相当一部分可以实现可溶性表达，从而有利于后续的纯化。
如果在GST标签和目的蛋白之间含有位点特异性的蛋白酶识别位点，如PreScission Protease, TEV Protease或Thrombin等，则可用相应的蛋白酶切除GST标签。通常在目的蛋白的N端加上GST标签可以保留GST的酶活性，从而便于使用Glutathione Beads 4FF进行GST标签重组蛋白的纯化。
本试剂盒中的Glutathione Beads 4FF采用了一种高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质，并使用了进一步优化的接臂和GSH偶联技术，可以高容量、高特异性地结合GST标签重组蛋白。和目前市售的大多数同类产品相比，非特异性蛋白结合更低，耐受压力更强，GSH的偶联更稳定。
Glutathione Beads 4FF凝胶的颗粒直径为45-165μm。可耐受的最大压力为0.025MPa，约合5.8psi。采用固定流速进行蛋白纯化时的推荐流速为0.5ml/min。
Ø Glutathione Beads 4FF储存在20%乙醇中，使用时宜把凝胶充分重悬后再吸取。
产品组分
编号 | 组分 | 规格 |
G10510 | Glutathione Beads 4FF | 5ml |
P1051A | 裂解缓冲液 | 100ml |
P1051B | 漂洗缓冲液 | 100ml |
P1051C | 洗脱缓冲液(需添加GSH使用) | 50ml |
P1051D | 溶菌酶 | 100mg |
P1051E | GSH | 153mg |
AC003 | 亲和层析柱空柱管(3毫升) | 10套/包 |
注：使用前请将GSH添加至D组分（洗脱液）中混匀
注意事项
1. 请勿在-20ºC或更低温度冷冻保存Glutathione Beads 4FF。
2. Glutathione Beads 4FF保存和纯化过程中应始终保持凝胶湿润。
3. 若离心不能完全除去蛋白样品中的不溶物，可以将样品溶液用0.45μm的滤膜过滤。
4. GST标签蛋白的纯化应始终保持在非变性条件下，如果融合蛋白以包涵体形式表达，在使用8M尿素或6M盐酸胍溶解包涵体后，需要通过透析去除尿素和盐酸胍并使蛋白复性后才能使用本产品进行纯化。
5. 蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4ºC或冰浴，以减缓蛋白降解。为有效抑制蛋白降解，可以在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物。
6. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
7. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
如下以最常见的大肠杆菌中表达纯化GST标签蛋白为例，说明本产品的使用方法。在其它体系中表达时，请参考该表达体系的相关使用说明，并借鉴大肠杆菌中纯化GST标签蛋白的使用说明。
1. 大肠杆菌中可溶性GST标签蛋白的诱导表达
如下以最常用的IPTG诱导表达系统给予说明，诱导表达条件的优化请参照所使用的诱导表达体系的详细说明。其它诱导表达系统请参考适当的使用说明进行。
a. 挑取表达GST标签蛋白的单克隆，接种到3ml或10-20ml含适当抗生素的LB培养液中，37ºC培养过夜。
b. 按照1:20的比例取培养过夜的菌液，接种到预热至37ºC并含适当抗生素的LB培养液中。例如取5ml培养过夜的菌液接种到100ml预热至37ºC并含适当抗生素的LB培养液中。具体的培养体积视需要纯化的蛋白量而定，初步的鉴定培养3-10ml即可；常规的表达纯化，通常可考虑培养100-200ml；制备型的纯化，培养体积可以达到1L或更大。如果希望取得更好的表达效果，建议按照1:100的比例接种过夜培养的菌液，但后续培养至相应的OD值需要更长的时间。
c. 37ºC常规培养约30-60min或更长时间，至菌液的OD600达到0.6-1.0。
d. 加入IPTG至终浓度为1mM，37ºC诱导表达2-4小时。
注：可以在加入IPTG前取出少量菌液同样培养2-4小时后作为未诱导的对照，也可以在加入IPTG前直接取出少量菌液作为未诱导的对照。对于特定蛋白的诱导表达，最佳的IPTG浓度、诱导温度、和诱导时间需要通过实验确定。
e. 收集菌液至离心管中，4ºC 4,000g离心20分钟或4ºC 15,000g离心1分钟，弃上清，收集沉淀。随后即可进入细菌裂解步骤，也可以在-20ºC或-80ºC冻存备用。冷冻保存的菌体使用前需置于冰上解冻15分钟。
2. GST标签蛋白的小量纯化
本方法常用于小量样品的快速分析和鉴定，为后续大量制备打下基础。
a. 接步骤1(e)，离心收集1ml菌液的细菌沉淀并弃上清，加入100μl裂解缓冲液，将细菌沉淀充分重悬于裂解缓冲液中，可进行轻微的涡旋振荡(尽量避免产生气泡)。
注：根据GST标签蛋白表达的丰度，菌液和裂解缓冲液的体积比可以在25:1-5:1范围内适当调整。表达丰度非常高时，每毫升菌液沉淀可以加入200μl裂解缓冲液；表达丰度非常低时，每毫升菌液沉淀可以加入40μl裂解缓冲液。相关溶液的配制方法附后。如有必要，在裂解细菌之前，可以在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物。
b. 加入溶菌酶至1mg/ml并轻轻混匀，尽量避免产生气泡，冰水浴或冰上放置30min。
注：溶菌酶可以用裂解液配制成100mg/ml的母液，临使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以适当分装后-20ºC保存。
c. 轻轻vortex数下，以充分裂解细菌，尽量避免产生气泡。
d. 4ºC离心(15000g×10min)，取10μl上清留样作后续检测用，收集余下上清至一新的洁净离心管中。
注：本步骤及后续步骤收集的上清必须保持澄清，即不含任何不溶物。上清中如果混有不溶性杂质会严重影响后续纯化获得蛋白的纯度。
e. 加入20μl混合均匀的 Glutathione Beads 4FF，4ºC在摇床上缓慢摇动30min，以充分结合带GST标签的目的蛋白。
注：缓慢摇动30min已经可以确保蛋白充分结合，但可以根据时间安排的需要缓慢摇动更长时间甚至缓慢摇动过夜。经测试，直接使用 Glutathione Beads 4FF也能获得良好的纯化效果。但如果希望获得更高的标签蛋白得率，可以参考步骤4，用与凝胶等体积的裂解缓冲液平衡Glutathione Beads 4FF 2-3次。平衡后，待纯化蛋白的得率通常会有所提高。
f. 4ºC离心(1000g×10s)沉淀凝胶，取20μl上清留样作后续检测用，其余上清弃去。
g.加入100μl 漂洗缓冲液重悬凝胶，4ºC离心(1000g×10s)，取20μl上清留样作后续检测用，其余上清弃去。
h. 重复步骤g，再进行一次洗涤。
注：如有需要，可根据具体情况使用酶切融合蛋白的GST标签从而释放目的蛋白。详细的GST标签酶切操作请参考步骤5，GST标签的酶切去除。
i. 加入20μl洗脱缓冲液，轻轻重悬凝胶。4ºC离心(1000g×10s)，收集上清及凝胶。上清即为纯化获得的带有GST标签的目的蛋白。
j. 重复步骤i两次。共洗脱并收集约60μl纯化的蛋白样品。
3. GST标签蛋白的大量纯化
本方法适用于较大量(例如菌液体积在50ml及以上)蛋白样品的纯化。
a. 接步骤1(e)，对于新鲜的或解冻的细菌沉淀，按照每克细菌沉淀湿重加入4ml(2-5ml均可)的比例加入裂解缓冲液，充分重悬菌体。如有必要，可以在裂解细菌之前，在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物。
b. 加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml并混匀，冰水浴或冰上放置30min。
注：溶菌酶可以用裂解液配制成100mg/ml的母液，临时用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以适当分装后-20ºC保存。
c. 冰上超声裂解细菌。超声功率200-300W，每次超声处理10s，每次间隔10s，共超声处理6次。
注：具体超声处理的方式须根据特定型号的超声仪器自行摸索和优化。
d. (可选做)如果超声处理后裂解液非常粘稠，可以加入RNase A至10μg/ml及DNase I至5μg/ml，冰上放置10-15min。或者也可以使用适当的装好了较细针头的注射器，反复抽吸数次，以剪切粘稠的基因组DNA等。
e. 4ºC 10,000g离心20-30min，收集细菌裂解液上清并置于冰水浴或冰上。可以取20μl上清留作后续检测用。
注：上清必须保持澄清，即不含任何不溶物，才能进行下一步的纯化。上清中如果混有不溶性杂质会严重影响后续纯化获得蛋白的纯度。
f. 取1ml混合均匀的Glutathione Beads 4FF，4ºC离心(1000g×10s)弃去储存液，向凝胶中加入0.5ml裂解缓冲液以重悬并平衡凝胶，4ºC离心(1000g×10s)弃去液体，再重复平衡1-2次，弃去液体。将约4ml细菌裂解液上清加入其中，4ºC在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动60min。
g. 将裂解液和Glutathione Beads 4FF的混合物装入本试剂盒提供的亲和层析柱空柱管(3ml)中。
注：也可先取1ml混合均匀的50% Glutathione Beads 4FF装柱，然后用0.5ml裂解缓冲液平衡2-3次后加入约4ml细菌裂解液上清，后续可以把流穿液收集后重复上柱3-5次以充分结合目的蛋白。先混合后装柱的方式操作起来相对麻烦一些，但更有利于GST标签蛋白与填料的充分结合。
h. 将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出，收集约20微升流穿液作后续分析用。
i. 洗柱5次，每次加入0.5-1ml漂洗缓冲液，每次均收集约20微升穿柱的液体用于后续的分析检测用。洗柱及下一步洗脱过程中可以用Bradford法(B5105/6)简单快速地检测每次洗涤液和洗脱液中的蛋白含量，从而考虑增加或减少洗涤和洗脱的次数。
注：如果出现后续获得蛋白纯度不够高的情况，可以再增加洗柱次数2-3次。若有需要，也可以用酶切融合蛋白的GST标签从而释放目的蛋白。详细的GST标签酶切去除的方法请参考步骤5，GST标签的酶切去除。
j. 洗脱目的蛋白6-10次，每次用0.5ml洗脱缓冲液。将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中。收集获得的洗脱液即为纯化的GST标签蛋白样品。
4. GST标签的酶切去除
大多数情况下，融合表达的GST标签不会影响目的蛋白的活性，可以用完整的融合蛋白进行活性检测。如果GST标签可能影响目的蛋白的活性，那么在构建质粒时可以在GST标签和目的蛋白之间加入适当的蛋白酶的识别位点，例如PreScission Protease、TEV Protease或Thrombin等的识别位点，这样就可以在柱上(on column)或洗脱后用相应的蛋白酶切除GST标签。
由于PreScission Protease能在4ºC进行高效的酶切，而TEV Protease或Thrombin的最佳酶切温度是室温而且耗时较长，因此推荐在设计目的蛋白的GST标签时，添加PreScission Protease识别的酶切位点。使用PreScission Protease进行GST标签的切除进行详细的说明如下：
a. 柱上酶切含GST标签的融合蛋白(以8mg GST标签蛋白/ml凝胶为例)
(a) 在GST标签蛋白结合于纯化柱(0.5ml)并用洗涤液充分洗涤后，再用5ml PreScission Protease的酶切缓冲液平衡柱子。 PreScission Protease的酶切缓冲液的组分为50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT, pH7.5。
(b) 准备PreScission Protease：约每毫克GST标签蛋白使用20U PreScission Protease。对于4mg GST标签蛋白需使用80U PreScission Protease，用PreScission酶切缓冲液稀释至与凝胶柱相同的体积，即0.5ml。
(c) 将稀释好的0.5ml PreScission Protease加入纯化柱中，4ºC保持4h(为确保酶切完全，可以4ºC酶切过夜)。如果蛋白结合是在离心管中进行的，可将准备好的PreScission Protease直接加入离心管中，4ºC在摇床上缓慢摇动4小时(为确保酶切完全，可以4ºC酶切过夜)。
(d) 用0.5ml PreScission Protease酶切缓冲液洗涤，重复三次，分别收集每次的洗涤液。如果酶切反应是在离心管中进行的，1000g离心2分钟，收集上清，然后加入0.5ml酶切缓冲液重新沉淀，离心(1000g×2min)收集上清，接着再加入0.5ml酶切缓冲液重新沉淀，离心(1000g×2min)收集上清。洗脱组分中含有切除了GST标签的目的蛋白，而GST标签和带有GST标签的PreScission Protease则仍然结合在凝胶柱上。
b. 洗脱后酶切含GST标签的融合蛋白(以8mg GST标签蛋白/ml凝胶为例)
(a) 使用脱盐柱快速除去洗脱组分中的GSH，或用PreScission Protease酶切缓冲液进行透析。
(b) 按每100μg GST标签蛋白加入2U PreScission Protease的比例加入蛋白酶，如果蛋白未定量，可以按照每0.5ml凝胶加入80U PreScission Protease (按照每毫升凝胶结合8mg GST标签蛋白进行预估)的比例进行。4ºC孵育4h。
(c) 将酶切后的蛋白样品加入预先用PreScission Protease酶切缓冲液平衡好的Glutathione Beads 4FF，室温结合20-30分钟。
(d) 500g离心5分钟，收集上清，其中含有切除了GST标签的目的蛋白，没有消化的GST标签蛋白和PreScission Protease则结合在凝胶沉淀中。
常见问题一：没有收集到目标蛋白
在蛋白纯化过程中，使用洗脱液对填料上的目标蛋白进行洗脱，在收集液中没有检测到目标蛋白。
问题自查 1:蛋白表达情况怎么样？ 目标蛋白是否有正常表达？标签是否正常表达且没有被折叠覆盖？
（1）蛋白样品在用填料纯化之前，先跑下 SDS-PAGE 胶并用考马斯亮蓝染色，如果能看到比较清晰且较粗的目标蛋白条带 ，则表达量较高；
（2）蛋白样品跑 WB，用标签抗体检测，如果能检测到目标条带，则标签有正常表达；
（3）检测蛋白样品中的蛋白浓度，并结合 SDS-PAGE 显示的目标蛋白的占比，可以估算出目标蛋白的表达量;
（4）或者也可以考虑在目标蛋白同时加上 GFP 等荧光标记，通过荧光检测得到蛋白表达量；
（5）如果蛋白上清液中没有检测到蛋白 ，且在沉淀中有大量蛋白 ，此时可能是蛋白形成了包涵体
优化方案：如果蛋白表达量不高，需要对前期质粒构建和蛋白表达过程进行优化。例如更换表达载体，更换标签，进行密码子优化，筛选大肠杆菌培养温度和时间，筛选诱导剂（如IPTG）浓度 ，诱导温度和时间等；
问题自查 2： 目标蛋白到哪里去了？ 是没有结合在柱子上 ，还是在柱子上没有洗脱下来？
同时收集上样和洗杂时的流穿液以及洗脱目标蛋白时的洗脱液，如果流穿液中有大量的目标蛋白 ，则表示目标蛋白没有和填料有效结合；如果流穿液和洗脱液中都没有目标蛋白，则表示目标蛋白可能还结合在柱子上 ，没有洗脱下来；
实验优化一：流穿液中有目标蛋白
His 标签
①样品或结合缓冲液条件不合适 ：样品和结合缓冲液中不能含有高浓度的金属螯合剂（例如 EDTA） ，高浓度强还原剂（例如 DTT） ，或者高浓度的咪唑；
②His 标签和填料结合较弱：适当降低上样流速并增加孵育时间；增加 His 标签的数量（6-10 个）；
③调整结合缓冲液的 PH 为 7-8 ， PH 过低会影响蛋白结合；上样量超出填料载量：使用更大体积的层析柱；
GST 标签
① 标签未正确表达： SDS-PAGE 检查目标蛋白分子量是否正确 ，WB 使用抗 GST 抗体确认标签存在。
② 目标蛋白折叠阻碍 GST 标签暴露：在 GST 与目标蛋白间插入柔性连接肽（如15-20个 Gly-Ser 重复序列）。
③蛋白未溶解或形成包涵体：优化表达条件（如降低诱导温度至 16-25℃或降低 IPTG浓度至 0.1-0.5 mM） ；尝试变性溶解（如 6 M 盐酸胍/8 M 尿素）后复性。
④宿主蛋白酶水解目标蛋白或 GST 标签 ：添加蛋白酶抑制剂（如 PMSF、 EDTA 等）
⑤EDTA（>5 mM)、甘油（>10%)可能降低结合效率； β-巯基乙醇会不可逆破坏GSH 树脂，需避免使用；高浓度还原剂 DTT（>5 mM)会破坏结合，需降低浓度至 1-2 mM或改用 TCEP（防止还原型谷胱甘肽氧化）。
⑥pH 或盐浓度不当 ：GST 结合最适 pH 7.0-8.0 ；盐浓度通常 100-300 mM NaCl。
⑦缓冲液中混入游离 GSH（如洗脱液残留）会竞争性抑制结合：透析或置换缓冲液，确保无游离 GSH。
⑧填料长期储存不当（应 4℃保存，避免冻融或干燥）或反复使用后配基脱落：用已知可结合的 GST 标准蛋白测试填料活性。
⑨上样流速过快 ：建议保留时间 3-5 min ，孵育 10-30 min 可提高结合率。
⑩洗脱液浓度不够 ，可尝试使用含 10-40 mM 还原型 GSH 的洗脱液 ，拉梯度分段收集洗脱样品。
⑪GST 本身可形成二聚体 ， 若目标蛋白也形成聚集体 ， 可能影响结合： 非还原SDS-PAGE 或 SEC 检查聚集状态。
⑫填料批次差异 ：更换填料。
MBP 标签
①标签未正确表达：SDS-PAGE 检查目标蛋白分子量是否正确，WB 使用抗 MBP 抗体确认标签存在。
②目标蛋白折叠阻碍 MBP 标签暴露 ：在 MBP 与目标蛋白间插入柔性连接肽（如15-20 个 Gly-Ser 重复序列）。
③蛋白未溶解或形成包涵体：优化表达条件（如降低诱导温度至 16-25℃或降低 IPTG浓度至 0.1-0.5 mM） ；尝试变性溶解（如 6 M 盐酸胍/8 M 尿素）后复性。
④ 宿主蛋白酶水解目标蛋白或 MBP 标签：添加蛋白酶抑制剂（如 PMSF、EDTA 等）。
⑤高浓度咪唑（>20 mM)、 EDTA（>1 mM)、甘油（>10%)可能竞争性抑制结合：推荐缓冲液 20 mM Tris-HCl +200 mM NaCl pH 7.4-8.0 +1 mM EDTA（可选）。
⑥pH 或盐浓度不当 ：MBP 结合最适 pH 7.0-8.0；盐浓度通常 150-300 mM NaCl。
⑦缓冲液中混入麦芽糖（如培养基残留）会竞争性结合 MBP：透析或置换缓冲液，确保无游离麦芽糖。
⑧填料长期储存不当（应 4℃保存，避免冻融或干燥）或反复使用后配基脱落：用已知可结合的 MBP 标准蛋白测试填料活性。
⑨上样流速过快 ：建议保留时间 3-5 min。
⑩柱子平衡前没有做好清洗会影响平衡效果和蛋白结合 ，新柱子第一次使用建议做C IP 清洗。
⑪填料批次差异 ：更换填料。 "
实验优化二： 目标蛋白没有洗脱下来：
His 标签
①洗脱条件过于温和 ：适当增加洗脱缓冲液中的咪唑浓度 ，或者尝试降低洗脱液的 PH；增加洗脱步骤和时间；
②目标蛋白与填料发生非特异性结合 ：在洗脱缓冲液中加入非离子型去垢剂（例如2% Triton X-100） ，或者增加洗脱液中 NaCl 的浓度
③目标蛋白在填料上发生了沉淀 ：减少上样量 ，添加去垢剂或者在变性条件下进行洗脱；
GST 标签
①增加洗脱缓冲液的用量 ，增长洗脱时间；
②适当提高洗脱缓冲液中还原型谷胱甘肽的浓度（20-40 mM）；
③洗脱缓冲液 PH 过低 ：提高 PH 至 8-9 可促进洗脱；
④提高洗脱液中的离子强度（适当增加 0.1-0.2 M NaCl）；
⑤适当加入 DTT（1-10 mM）抑制还原型谷胱甘肽被氧化；
⑥目标蛋白和填料间发生非特异相互作用：在洗脱缓冲液中加入非离子型去垢剂（例如 0.1% Triton X-100）
MBP 标签
①提高麦芽糖浓度 ：将洗脱液中的麦芽糖从标准 10 mM 增至 20-50 mM ，最高可尝试500 mM
②增加盐浓度 ：在洗脱缓冲液中加入 0.5-1 M NaCl ，破坏非特异性相互作用孵育 ，而非柱层析 ，提高洗脱效率
③4°C 过夜孵育 ：降低流速或延长洗脱时间 ，让蛋白充分解离（注意蛋白稳定性）
常见问题二：蛋白纯度不高 ，杂带较多
问题描述：收集液中有目标蛋白，但同时也有很多杂蛋白。这种情况一般发生在使用His 标签时， 以下主要对 His 标签蛋白纯化进行讲解。
问题自查 1 是否目标蛋白本身表达不高 ，而杂蛋白表达较高
实验优化 1：按照问题 1 中的方法检测目标蛋白表达；优化质粒构建和蛋白表达的步骤；
问题自查 2 蛋白是否容易降解？
在 SDS-PAGE 胶上观察杂带的分子量；如果杂带的分子量比目标蛋白分子量小，且相差值约为几个结构域或特定酶切位点，说明可能该杂带是由目标蛋白降解产生的。
优化方案：
（1）使用线性洗脱的方式： 500 mM 咪唑 ，0%-100%线性梯度洗脱 10 CV；
（2）漂洗缓冲液中加入少量咪唑；
（3）裂解液和缓冲液中添加去垢剂（2% Triton X-100/Tween 20）；或添加甘油（20%以内） ；增加缓冲液中 NaCl 浓度至 500 mM
（4）其他考虑方向包括 His 标签蛋白被部分降解 ，优化结合和洗脱条件 ，尝试不同金属离子螯合的填料，构建双标签蛋白，添加去垢剂，还原剂等添加剂破坏杂质和目的蛋白间的相互作用等等
（5）在镍柱纯化之后增加离子交换和分子筛等步骤继续纯化；
常见问题三：填料变色
（1）镍柱变白 ：如果上样量较大 ，镍柱填料可能由于结合了大量的蛋白而呈现发白的现象 ，这是正常的；
但如果缓冲液中存在螯合剂如 EDTA 等 ，可能导致镍离子从柱上脱落而发白 ，并且导致目的蛋白的结合量降低；
（2）镍柱出现棕色 ：这主要是缓冲液中还原剂的影响。在常规的填料中存在的游离镍离子 ，可能会被 DTT 还原生成棕色的沉淀。
（3）杂质与目的蛋白有相互作用 ：加入去垢剂、还原剂、甘油等破坏杂蛋白与目的蛋白之间的相互作用 ，或者尝试调整缓冲液的盐浓度。
常见问题四：柱子堵了
问题描述：柱子发生堵塞，流速降低，压力增高；此时需要根据说明书对层析柱进行清洗。
问题自查 1 样品和缓冲液上样前有没有过滤？
实验优化 1 ：收集到蛋白样品之后，建议先用超声破碎，然后离心取上清，然后使用0.45um 或者 0.2um 的滤膜进行过滤；
问题自查 2 是否样品浓度或者粘性过高？
实验优化 2 ：可以适当稀释样品；如果样品粘性比较高，也可能是样品中含有高浓度的宿主核酸，可以增加超声时间，或者加入核酸酶（5 ug/ml DNase1, 1 mM Mg2+）进行处理。
问题自查 3 层析柱有没有定期清洗？
实验优化 3 ：层析柱在使用 5-10 次之后，建议对层析柱进行清洗。清洗方法可以参考说明
常见问题五:填料应该如何清洁再生？
His 标签
常规清洗：可使用 5-10 倍柱体积的纯水或者漂洗缓冲溶液对柱子进行清洗。
当填料在使用过程中发现反压过高或者填料上出现明显污染，需要进行在位清洗（CIP）操作。
N30210/N30230 填料在位清洗前需先去除镍离子，（不脱镍直接上碱洗可能会产生棕色沉淀导致柱子堵塞） ；为了避免不同样品间的相互干扰，或者当介质污染比较严重时(反压增加) ，需要对介质进行在位清洗。在位清洗前，需要预先除去介质上螯合的金属离子(见再生操作) 。在位清洗时，可采用反向冲洗的方法。
1)对于以离子键结合的蛋白，可用 2~3CV 以上的 2M NaCl 清洗，
2)对沉淀蛋白、以疏水性结合的蛋白或脂蛋白，可用 1MNaOH 清洗(1~2h)，并用 3~10CV平衡液和 3 CV 以上的纯水冲洗。
3)对疏水性结合的蛋白、脂蛋白和脂类物质，可用 5~10CV 的 70%乙醇或 30%异丙醇清洗(20min 以上) ，并用 3~10CV 的纯水冲洗。
此外，也可用2CV 含去污剂的碱性或酸性溶液清洗。如用 0.1~0.5%的非离子去污剂+0. 1M乙酸冲洗 1~2h ，并用 5~10CV 的 70%乙醇冲洗去除去污剂，然后用 3~10CV 的纯水冲洗。
N30250 填料可直接进行在位清洗
当填料在使用过程中发现反压过高或者填料上出现明显污染，需要进行在位清洗操作。
1) 去除强疏水性结合的蛋白、脂蛋白和脂类
方法一:使用 30%异丙醇清洗 5~10CV ，接触时间为 15~20min 可以去除此类污染物，再用 10CV 的纯水清洗;
方法二:使用 0.3M 或 0.5M NaOH 溶液冲洗填料 3CV ，然后用 10-15CV 的纯水清洗。
2)去除离子作用结合的蛋白
使用 1.5M NaCI 溶液清洗 10~ 15min ，再用 10CV 纯水清洗，清洗好
的柱子用 2CV 的 20%乙醇冲洗，置于 2~8°C 保存。
GST 标签
GST 标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生，但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量性能下降, 这时需要对填料进行清洗。
去除一些沉淀或变性物质：用 2 倍柱体积的 6 M 盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用 5倍柱体积的 PBS, pH 7.4 清洗。
去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质：用 3-4 倍柱体积的 70%乙醇或 2 倍柱体积的 1% Triton X-100 清洗，然后立即用 5 倍柱体积的 PBS, pH 7.4 清洗。
MBP 标签
随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量都下降，这时可按照下面方法对填料进行清洗。
1）3 倍柱体积的去离子水;
2）3 倍柱体积的 0.1% SDS 或 0.1 M NaOH 溶液;
3）3 倍柱体积去离子水，20%乙醇 2-8℃保存。
Strep 标签
继续纯化同一目的蛋白时：用 5-15 CV 的含平衡液洗柱，柱子可重新使用。
当纯化不同蛋白或突变体时：用 3 CV 的去离子水清洗，用 5-15CV- 10-50 mM NaOH 再生，然后用 3 CV 的去离子水清洗
常见问题六：摇菌 250ml ，用填料纯化最少需要几毫升？
常规来说 250ml 菌液可以摇出 1g 左右菌泥，重悬破碎体积为 10ml 左右，大约用 0.5-1ml左右的填料就够了，填料载量是 XX mg/ml 左右。
也和客户的蛋白表达量有很大关系，如果客户的蛋白表达量明显偏低或偏高的话，填料量是需要对应减少或增加的。客户可以破碎后先跑个电泳看下大致表达情况。
常见问题七：标签蛋白纯化试剂盒的缓冲液组分是什么？
H1032/H1035 试剂盒配方
裂解液：ripa 中
结合缓冲液：ripa 中（50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate， 0.1% SDS 等）
漂洗缓冲液：20mM 咪唑，0.3M NaCl ，50mM Tris pH7.9
洗脱缓冲液：500mM 咪唑，0.5M NaCl ，50mM Tris pH7.9
P1051 试剂盒配方
裂解：10mM PBS (一袋的量)+1%Triton X- 100 (10mL)
漂洗：10mM PBS(一袋的量)
洗脱：10mM PBS(一袋的量）+10-15mM reduced glutathione (3.07323g)
M1051 试剂盒配方
裂解：20 mM Tris pH7.4 ，200 mM NaCl ，1 mM EDTA 根据需求加 DTT PMSF
漂洗：50mM Tris-HCl PH:8.0(50mL) ，500mM NaCl（29.22g）
洗脱：50mM Tris-HCl PH:8.0(50mL) ，500mM NaCl（29.22g），额外加 20mM 麦芽糖
常见问题八：标签该如何选择？
标签的选择主要是根据蛋白的特点以及对纯度的要求，新手建议可以从 His 标签开始做起。
①His 标签标签小，纯化步骤简便，纯化条件温和，能纯化可溶性/包涵体蛋白，一般不会影响蛋白的功能结构，且可以产出大量的目标蛋白，纯度和其他标签相比略低，如果对纯度不是要求特别高的情况下首选；
②GST 标签洗脱条件温和，有助于保持蛋白功能活性，适合 pull-down 检测，具有很好的线性动态范围，但分子量较大，需要在纯化后去除标签，且不适宜变性环境；
③MBP 标签可以减少目标蛋白的降解，增加蛋白的表达量和稳定性，提高表达产物的水溶性，但标签较大，对蛋白的结构和功能可能会有一定影响；
④Strep 标签能纯化出高纯度的目标蛋白，纯化条件温和，能进行变性条件下的纯化。纯化柱和填料的价格和其他标签相比略高；
