产品货号：P0233G

储存条件：2℃-8℃

1.产品简介

ProteinA/GBeads4FF是将ProteinA/G高密度定向偶联到高度交联的琼脂糖凝胶微球表面，该产品具有更高的抗体结合能力和较低的蛋白非特异吸附率，洗脱条件更均一，一步纯化即可从血清样品中分离出纯度大于90%的抗体。产品性能见表1。

本产品主要用于免疫沉淀(IP)以及免疫共沉淀(Co-IP)研究，也可用于抗体固定及其它相关研究。用户可根据目标抗体的种属来源及亚型选择微球的类别。

表1.ProteinA/GBeads4FF产品性能

2.纯化流程

本产品主要应用于免疫沉淀(IP)以及免疫共沉淀(Co-IP)研究。

2.1缓冲液的准备

所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。

平衡/洗杂液：0.15MNaCl，20mMNa2HPO4，pH7.0

洗脱液：0.1M甘氨酸，pH3.0

中和液：1MTris-HCl，pH8.5

交联液：0.2M三乙醇胺，pH8.2

交联剂：DMP(dimetylpimelimidatedihydrochloride)

终止液：50mMTris，pH7.5

2.2样品准备

上柱前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用平衡/洗杂液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用平衡/洗杂液透析。对于100mm培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，使用预冷PBS洗涤一次后加入2ml细胞裂解液裂解细胞。对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。植物或动物组织样品可以使用液氮研磨方法裂解。具体的裂解方法请参考不同裂解液的使用说明，裂解液最终总蛋白浓度选择在0.5-1μg/μl范围内较为合适。通常针对目标蛋白的表达量不同，需要对总蛋白浓度进行预实验调整。

2.3去除非特异性结合(可选)

1)取200μl至1ml蛋白样品，加入约1μg和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的NormalIgG和20μl充分重悬的ProteinA/GBeads4FF，4C缓慢摇动30min。

2)2500rpm(约1000×g)离心1min，取上清用于后续的免疫沉淀。注：哺乳动物细胞内有多种成分可以和IgG发生结合，可能会在后续免疫印迹中出现非特异性条带。使用normalIgG和ProteinA/GBeads4FF对裂解液预处理可以降低非特异性吸附。

2.4免疫沉淀操作流程

2.4.1抗体吸附

1)取适量的ProteinA/GBeads4FF加入到2ml离心管中，800rpm离心1min，吸弃上清。

2)加入0.5ml平衡液，悬浮填料(使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用)，800rpm离心1min，吸弃上清。再重复两次。

3)向步骤2)平衡的填料中加入抗体溶液，悬浮填料，室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，约30min后，800rpm离心1min，收集上清液，留待检测。

4)向3)的填料中加入0.5ml的洗杂液，悬浮填料，进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，800rpm离心1min，吸弃上清。再重复两次。

2.4.2抗体交联(备选)

如果需要将抗体和目标抗原复合物共同洗脱，请忽略本步骤，直接进行2.4.3。50μl-1ml填料量均可以按照以下步骤操

作，无需额外增加交联液体积。

1)向清洗过的填料中加入1ml交联液，800rpm离心1min，吸弃上清。

2)再向其中加入1ml含20mMDMP(dimetylpimelimidatedihydrochloride)的交联液，此试剂需要现用现配，悬浮填料，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，促使缓冲液和填料充分接触，约30min后，800rpm离心1min，吸弃上清。

3)再向其中加入1ml终止液，悬浮填料，终止交联反应，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，约15min后，800rpm离心1min，再吸弃上清。

4)加入0.5ml的洗杂液，悬浮填料，进行清洗，800rpm离心1min，吸弃上清。再重复两次。

2.4.3抗原沉淀反应

1)抗原吸附：加入含有抗原的样品(来源2.2或2.3)，用移液器轻轻吹打使抗原与填料-抗体复合物均匀分散。在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管10min，使抗原与抗体充分结合，如结合力较弱则可在室温下反应1h或者在4C下反应过夜。

2)洗杂：将上述完成抗原吸附的填料-抗体-抗原复合物进行离心，800rpm离心1min，收集上清液，置于冰上以备后续检测。向离心管中加入1ml洗杂液，用移液器轻轻吹打使填料-抗体-抗原复合物均匀分散，然后进行离心分离，800rpm离心1min，弃上清液。再重复洗涤两次。最后加入1ml洗杂液，用移液器将填料-抗体-抗原复合物悬液转移至新的1.5ml离心管中，并进行离心分离，800rpm离心1min，弃上清液。

3)抗原洗脱：提供以下两种抗原洗脱方案，可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。

变性洗脱法：此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。向离心管中加入25μl1×SDS-PAGELoadingBuffer混合均匀，95C加热5min。然后进行离心，800rpm离心1min，收集上清液，进行SDS-PAGE电泳，转膜后进行Western分析。

非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向离心管中加入5倍柱体积的洗脱液，用移液器吹打5次，混匀，然后在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，10min后，离心，800rpm离心1min，吸取上清液，收集洗脱组分，即为目标抗原，收集上清液至新的离心管中，并立即加入十分之一体积的中和液，将洗脱组分pH调节至7.0-8.0，用于后期功能分析。

2.5免疫沉淀操作流程2

1) 抗体与抗原混合：将抗体与含有目的蛋白的裂解液(来源2.2或2.3)混合，室温震荡孵育30min-60min，或者

2-8℃孵育过夜，取决于抗体与抗原的结合效率以及抗原的稳定性，需要自己优化结合条件。形成抗原-抗体混合物。

注意：抗体的加入量要考虑到下面填料的量，抗体的加入量过多会影响到抗原-抗体混合物与填料的结合。建议抗体加入量为填料80%的最大载量。

2)填料准备：取适量的ProteinA/GBeads4FF加入到2ml离心管中，800rpm离心1min，吸弃上清。加入0.5ml平衡液，悬浮填料(使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用)，800rpm离心1min，吸弃上清。再重复两次。

3)抗原-抗体混合物的吸附：将步骤1)中得到的抗原-抗体混合物加入到处理好的填料中，混合均匀，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，促使样品和填料充分接触并吸附，约30min后，800rpm离心1min，收集上清液，留待检测。

4)洗杂：向上述离心管中加入0.5ml的洗杂液，悬浮填料，进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，800rpm离心1min，吸弃上清。再重复两次。

5)抗原洗脱：提供以下两种抗原洗脱方案，可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。

变性洗脱法：此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。向离心管中加入25μl1×SDS-PAGELoadingBuffer混合均匀，95C加热5min。然后进行离心，800rpm离心1min，收集上清液，进行SDS-PAGE电泳，转膜后进行Western分析。

非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向离心管中加入5倍柱体积的洗脱液，用移液器吹打5次，混合均匀，然后在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，10min后，800rpm离心1min，吸取上清液，收集洗脱组分，即为目标抗原，收集上清液至新的离心管中，并立即加入十分之一体积的中和液，将洗脱组分pH调节至7.0-8.0，用于后期功能分析。