货号 ：PGA0xx/PHA0xx/PFA0xx/PMA0xx/PRA0xx/PBA0xx/PVA0xx

存储条件 ：-20°C 保存 ， beads 经常使用可在 4℃保存 ，-80 或-20℃可长期保存 ，阳性对照蛋白建议分装后-80 保存 ，阳性对照蛋白与 beads 避免反复冻融。

试剂盒组分：

产品简介：

LABLEAD 的免疫沉淀 beads 是基于基因工程改造的纳米抗体开发的；纳米抗体由传统抗体的重链可变区（VHH）组成 ，具有分子量小、亲和力高、特异性强 ，且耐酸碱高温环境等特点；基于纳米抗体的优点 ， LABLEAD 的免疫沉淀 beads 避免了免疫沉淀结果出现轻重链污染的现象，并且节省实验时间。本试剂盒配齐了免疫沉淀实验所需全部的缓冲液 ，可方便快捷完成免疫沉淀实验。

实验步骤：

提示 ：尽量在 4℃进行操作 ，洗脱蛋白方法一除外。

1.植物组织裂解处理：

取适量植物组织样本（叶片等） 放置于冷冻液氮中 ，之后将冷冻后得植物组织样本放于研钵进行研磨 ，尽可能充分研磨破坏其细胞壁。加入500-1000ul 裂解液 A 或裂解液 B（需加入 PMSF 溶液）进行裂解 ，为了提高裂解效率 ，可加入 200ul 玻璃粉（非必需）按照 600—800g 离心力充分震荡  30min ，裂解完成后  12000 rpm ，离心  30min ，吸取上清置于新的离心管中 ，弃去沉淀。（进行第 3 步）

2.    动物细胞

2.1 收集细胞：

根据实验要求收集适量的细胞 ，通常每个免疫沉淀反应大约使用  106-107  个细胞。

2.2 裂解细胞：

根据实验要求选择使用溶液 A 或溶液 B 裂解细胞。在溶液 A 或溶液 B 中加入蛋白酶抑制剂，用 500μl 预冷的溶液 A 或溶液 B 重悬细胞（溶液具体的选择可参考注意事项 1） ；置于冰上 30 分钟 ，可每 10 分钟充分吹打一次；细胞裂解物4℃ ,  20,000g 离心 15 分钟 ，将裂解产物（上清）转移到一个新的预冷管中 ，丢弃沉淀。

3. 平衡珠子：

振荡充分混匀珠子 ， 吸取 20μ l 对应标签的Agarose beads 到 500μ l 预冷的溶液 A 或溶液 B 中，4℃ ,  2,500g离心 2 分钟 ，丢弃上清液。（如需同时做阳性对照 ，建议取 40ul beads 进行平衡）

4. 结合蛋白：

实验组：将平衡好的 20ul beads 加入到细胞裂解产物中 ，于 4℃旋转混合结合 30min-1h（不建议孵育过长时间 ，以免造成不稳定蛋白的降解）

阳性对照组 ：取 1.5ml ep 管 ，加入100ul 阳性对照蛋白（试剂盒中组分），添加 10ul beads  于管中 ，4℃孵育旋转混合结合 30min-1h。

5. 清洗珠子：

根据实验要求选择使用漂洗液 C 或漂洗液 D（可参考注意事项 1 选择合适的漂洗液）清洗 beads。4℃ ,   2,500g 离心 2 分钟 ，丢弃上清液。用 500μ l预冷的漂洗液 C 或漂洗液 D 重悬 beads ，4℃ ,   2,500g 条件下离心 2 分钟 ，丢弃上清液并重复洗涤 3 次。

6. 洗脱蛋白

方法一（煮沸洗脱，适用于不回收beads的情况）：

加入 20μl 2×SDS-loading buffer 重悬 beads。95℃ ,  加热 10min 充分变性 ，2,500g 离心 2 分钟收集上清 ，收集的产物可进行 SDS-PAGE 及免疫印迹分析。（loading buffer 如果未4x/5x 的可用ddH2O进行稀释使用）

方法二（酸洗脱，可回收beads）：

加入 50ul 溶液 E 洗脱结合的蛋白，孵育时间 30 秒，期间不断混匀，2,500g 离心 2 分钟收集上清，为了中和酸性的甘氨酸，收集上清中立即加入 5μl 1.0 M Tris （pH10.4）。Beads 本身可通过PBS 清洗2-3次会回收重复使用

注意 ：为了提高洗脱效率可以重复这一步。收集的产物可进行 SDS-PAGE 及免疫印迹分析。

方法三（多肽洗脱，Flag/Myc/HA 等标签可用此种方式）

在清洗后的琼脂糖珠中加入50μl 对应标签的多肽洗脱液（参考浓度：150μg/ml），冰浴并摇床孵育30min-2h，为了提高洗脱效率，可延长孵育时间或重复洗脱步骤。多肽洗脱液体积一般为琼脂糖珠体积的5倍左右。

孵育后2500g 离心2分钟，收集含有免疫沉淀复合物的上清。琼脂糖珠可经过PBS/TBS清洗3-5次后回收，添加20%乙醇的PBS 置于4℃或者-20℃保存。

注：多肽洗脱条件需要摸索最优条件，为提高洗脱效率也可适当提高多肽的浓度进行洗脱。一般多肽的洗脱工作浓度在100-400μg/ml。

注意事项：

1、关于裂解液与裂解液的选择：

裂解液 A 为温和裂解液 ，裂解液 B 为强裂解液 ，请根据自己实验样本选择相应的裂解液 ，如：若为胞质蛋白可选裂解液 A 或者 A 与 B 混合使用 ，若为核蛋白则可选择裂解液 B。

漂洗液 C 和漂洗液 D 的选择：漂洗 D 为高盐溶液 ，可能会破坏蛋白间较弱的相互作用 ，若两个蛋白相互作用强 ， 同时还想减少非特异性结合 ，可选 D；若两个蛋白相互作用弱的优先 C。

2、为取得最佳的使用效果 ，尽量避免过多的反复冻融。可以适当分装后使用。

3、本产品仅限于专业人员的科学研究用 ，不得用于临床诊断或治疗 ，不得用于食品或药品。

4、为了您的安全和健康 ，请穿实验服并戴一次性手套操作。