产品货号：G1051P
产品说明
Glutathione Beads 4FF可以一步纯化各种表达系统表达的谷胱甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽依赖性蛋白和谷胱甘肽转移酶的重组衍生物。 Glutathione Beads 4FF是以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质，通过12个原子的间隔臂，用化学方法共价结合了还原型谷胱甘肽制作而 成。Glutathione Beads 4FF因其耐压的基质，可以在相对较高的流速下，实现对目的蛋白的纯化，更适合用于工业大规模蛋白的纯化。
表 1 Glutathione Beads 4FF 产品性能
项目 | 性能 |
基质 | 高度交联的4%琼脂糖凝胶 |
配体 | 通过12原子间隔臂偶连的谷胱甘肽 |
载量 | >10 mg GST-tagged protein(40 kDa) /ml 介质 |
微球粒径 | 45-165 pm |
最大压力 | 0.3 MPa, 3 bar |
pH稳定范围 | 3-12 |
储存缓冲液 | 含20%乙醇的1xPBS |
储存温度 | 2-8 °C |
纯化流程
1. 缓冲液的准备
缓冲液在使用前最好用0.22um或者0.45um滤膜过滤。
平衡/洗杂液：140 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4
洗脱液：用平衡液配制10mM还原型谷胱甘肽（现配现用）
注意：平衡液和洗脱液中可加入1-10 mM DTT
2. 样品准备
样品在上样前建议离心或用0.22um或0.45um滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
2.1细菌或酵母表达的蛋白
1）挑取单菌落到培养基中，根据载体使用说明，加入相应浓度的诱导剂诱导相应的时间。
2）表达结束后，将培养液转移到离心杯中，7000 rpm（7500xg）,离心15 min收集菌体，然后按照菌体：平衡液=1： 10（W/V）加入平衡液，加入终浓度为1 mM的PMSF。加入溶菌酶（工作浓度为0.2-0.4 mg/ml,如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加溶菌酶，同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与填料的结合）。
3）将菌体沉淀悬浮起来，（如果菌液浓度高，也可考虑加入10 ug/ml RNase A和5 ug/ml DNase I）,混匀，放置于冰上，然后冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。
4）将澄清的破碎液转移至离心管中，10000 rpm（15000xg）, 4°C离心20-30 min。取上清，置于冰上备用或-20°C保存。
2.2酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白
1） 将细胞培养液转移至离心杯，5000 rpm（3800xg）,离心10 min,收集菌体得上清，即可直接加入柱子使用。
2） 对于大量体积的上清，需加入硫酸铵沉淀浓缩后，蛋白还需用平衡液透析后才能加入柱子。
3. 层析柱的装填
3.1重力柱的装填
1）取合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。
2）将Glutathione Beads 4FF混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中（介质实际体积占悬液的一半），打开下出口流干保护液。
3）加入适量纯水冲洗介质，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。
4）装入润洗后的上垫片，确保垫片与填料之前没有空隙，且保持水平。
5）装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡，暂不使用时则加入保护液，2-8°C保存。
3.2中压层析柱的装填
装柱前根据层析柱直径计算柱子底面积，根据所需装柱高度计算所需介质体积，公式如下：
V = 1.15πr2h (V：所需介质体积ml；1.15：压缩系数；r：柱管半径cm；h：装填高度cm）
注意：所取悬液体积应为介质体积的两倍，因为介质体积只占悬液总体积的一半，另一半为保护液。
1） 用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留1-2 cm的去离子水。
2） 将介质悬浮起来，小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。
3） 如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。
4） 打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速，可以用所使用泵的最大流速，这样也可以得到一个很好的装填效果。（注意：在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%）当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。
5） 关闭泵，关闭层析柱出口。
6） 如果使用储液器，去除储液器，将分配器置于层析柱中。
7） 将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。
8） 将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。
4. 样品纯化流程
4.1孵育法纯化
1） 根据纯化样品量，取适量Glutathione Beads 4FF加入离心管中，1000rpm离心1 min,吸弃上清；也可加入重力柱中，流干保护液。
2） 向离心管中加入5倍介质体积的平衡液清洗介质，1000rpm离心1 min,吸弃上清；如使用重力柱，则直接在重力柱中清洗，直接重力流干平衡液；重复两次以上。
3） 加入样品，封闭离心管或重力柱管，4°C振荡孵育2-4h或者37°C孵育30 min-2h。
4） 孵育结束后，1000 rpm离心1 min,吸弃上清，或过滤收集介质，上清保留作为流穿，用于电泳鉴定。
5） 用5倍介质体积的洗杂液清洗介质，1000 rpm离心1 min或重力柱管过滤，去除上清（注意不要吸到介质），重复3-5次，中间建议更换新离心管。
6） 加入3-5倍柱体积的洗脱液进行洗脱，室温孵育10-15 min, 1000 rpm离心1 min或重力柱管收集洗脱液，可重复2-3次。
4.2重力柱法纯化
1） 将装填好的Glutathione Beads 4FF重力柱用5倍柱体积平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲液体系下，重复2-3次。
2） 将样品加到平衡好的重力柱中，样品保留时间至少2 min,保证样品和介质充分接触，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。
3） 用10-15倍柱体积的洗杂液进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
4） 使用5-10倍柱体积的洗脱液洗脱，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得 到高纯度和高浓度的蛋白。
4.3中压层析柱法纯化
Glutathione Beads 4FF装填好后，可以用各种常规的中低压色谱系统。
1） 将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中，打开下出口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。
2） 用3-5倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液。
3） 使用至少5倍柱床体积的平衡液平衡色谱柱。
4） 利用泵或样品环上样。
注:样品的粘度增加使得即使上样体积很少，也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。
5） 用洗杂液冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。
6） 使用5-10倍柱体积的洗脱液洗脱，收集洗脱液，即目的蛋白组分。
上述步骤洗脱结束后，用平衡液冲洗3倍柱体积，然后用纯水冲洗5倍柱体积，再用保护液冲洗2个柱体积，然后将介质置于2-8°C保存。
5. SDS-PAGE 检测
将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。
6. 填料清洗
GST标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生，但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量性能下降, 这时需要对填料进行清洗。
去除一些沉淀或变性物质，建议使用下面的方法
用2倍柱体积的6 M盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS, pH 7.4清洗。
去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质
用3-4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积的1% Triton X-100清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS, pH 7.4清洗。
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