货号：O041
存储条件：-20℃避光保存。有效期 1 年。
产品组分：
名称 | 规格 | |
A液 | DHE 红色荧光染料（5mM） | 0.2 ml |
B液 | Rosup阳性对照，50mg/mL | 1 ml |
产品描述：
活性氧(Reactive oxygen species,ROS)包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。活性氧检测试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一种利用荧光探针进行活性氧检测的试剂盒。二氢乙锭 DHE(Dihydroethidium)，可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的 ROS 氧化，形成氧化乙锭；氧化乙锭可掺入染色体 DNA 中，产生红色荧光。根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞ROS 含量的多少和变化。DHE 在细胞内主要被超氧阴离子型 ROS 氧化，用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察。
二氢乙锭本身为蓝色荧光，最大激发波长为 370 nm，最大发射波长为 420 nm，脱氢后与 RNA或 DNA 结合产生红色荧光，最大激发波长为 488～535nm（最适激发波长是 518nm），最大发射波长为 610 nm。
本试剂盒只可以用于细胞的活性氧检测，本底低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便。
自备器材：
激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或荧光酶标仪激发波长 488～535nm，发射波长 610nm。离心机，移液器，PBS/ HBSS/ HEPES 缓冲液（不含酚红和钙镁）等相关仪器。
使用说明（仅供参考）：
贴壁细胞染色：
(1) 使用前用 PBS 或者无血清培养基稀释母液至所需工作浓度，通常 5~20μM （按染色液：稀释液的比例为 1:1000 到 1：250）就可以满足实验需求，具体的浓度要根据实验需要进行进一步的调整。
(2) 以 96 孔板为例，细胞量在每孔 1x105-6时，加入的染色液量 200ul，工作液浓度在 5-20uM，室温避光孵育 60min 或 37°C 孵育 30-40min。
(3) 去除染色液，用 1xPBS 浸洗 2 次后，显微镜检测。
悬浮细胞染色
(1) 收集悬浮细胞，离心弃掉培养基，用 PBS/ HBSS/ HEPES 缓冲液（不含酚红和钙镁）将细胞调整为 1x105-6/ml 的细胞悬液。
(2) 200μL 的细胞悬液里面加入 1-2μL 的红色荧光染料原液（5mM），吹打混合均匀，室温避光孵育 60min 或 37°C 孵育 30-40min。
(3) 孵育后，250-500g 离心 5min-10min，去除染色液，用 PBS 清洗 2 次，显微镜检测。
阳性对照：
阳性对照 Rosup 可以按照 1：1000 的比例使用。例如装载好探针的细胞共 1mL,可以加入 1μL的阳性对照刺激。通常刺激后 0.5-4h 内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后 0.5h 内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。
对于某些特别的细胞，实验过程中如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以1:2500-1:1000 稀释探针的终浓度为 2-5μM。探针装载的时间也可以根据情况在 15-60 min 内适当进行调整。
酶标仪法：
1)样本处理:
刚取得的新鲜组织样本用PBS洗净。准确称取50mg组织，加入1mL匀浆缓冲液A,用玻璃匀浆器充分匀浆。在100xg，4°C离心3 分钟，弃沉淀，取上清。
2)样本检测:
在96孔板中加入200μL匀浆上清液、2μL DHE探针，用移液器吹打，使之充分混匀。在37°C避光孵育30分钟。置于荧光酶标仪中，后于激发波长为488~535nm、发射波长610nm检测荧光强度。
3)蛋白定量:
另取50μL.上清匀浆液，用PBS大约稀释30倍。取100μL进行蛋白定量。
4)结果处理:
以荧光强度/毫克蛋白表示组织活性氧强度。
注意事项
1. 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
2. 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。
3. 有的细胞装载探针后细胞容易漂起来，洗细胞时实验组会吸走一部分细胞。所以种细胞时细胞量增加一倍，这样细胞紧密连接，贴壁比较牢，实验组的荧光值可能就会升高。另外有的细胞对探针很敏感，建议工作液浓度适当低到 1-2μM。浓度太高容易有非特异性染色。
4. 探针经稀释后很不稳定，一旦氧化，本底荧光值就会升高，工作液建议现用现配。
5. 染⾊液为 DMSO 溶液，气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要充分融解后使用，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
6. 结果处理，推荐表示细胞活性氧强度=荧光强度/蛋白（mg），并且结合相关文献数据进行计算。
7. 如果是流式检测，推荐贴壁细胞用胰酶消化制备成单细胞悬液；悬浮生长细胞，直接收集细胞。用 PBS 重悬细胞 1x105-6/ml。
8. 活性氧阳性对照(Rosup) 仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加⼊活性氧阳性对照。
9. 定量需要作标准曲线。先做一个推荐不同浓度 H2O2（100-400μM）氧化荧光值，做标准曲线，X 轴为 H2O2浓度，Y 轴是荧光值，得出一个方程，再判断样品的荧光值即 Y 值是多少，计算出对应的 X 值即可。
10. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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