货号：YT0010
存储条件：E、F组分-20保存，其他组分常温保存
产品说明
酵母转化试剂盒提供了一种高效的聚乙二醇(PEG)/ liAc为基础的方法来制备和转化活性酵母细胞，本试剂盒可以用于任何酵母的转化实验。本试剂盒提供了比许多其他常用方法更高和更可靠的转化效率。库包含的克隆越多，就越有可能发现罕见的和潜在的新的互作。本试剂盒可最多进行50次小规模的酵母转化或者15次文库的转化。
产品组分：
货号 | 名称 | 规格 |
YT0010-A | 1M 醋酸锂溶液 | 50ml |
YT0010-B | 50% PEG3350 溶液 | 2*50ml |
YT0010-C | YPD Plus液体培养基 | 5g（可配100ml） |
YT0010-D | 10*TE buffer | 50ml |
YT0010-E | 10 mg/ml 鲑鱼精DNA（已变性处理） | 1ml |
YT0010-F | pGBT9 (positive control plasmid), 0.1 µg/µl | 20ul |
实验前试剂准备：
1.1X TE/醋酸锂 溶液配置：
转化前使用试剂盒提供的原液配置溶液（现用现配）：将1.1ml 10*TE buffer和1.1ml 1M 醋酸锂溶液混合，用无菌去离子水定容到10ml。
PEG醋酸锂 溶液配置：
用试剂盒提供的储存液配置溶液（现用现配）：取8ml 50% PEG3350溶液（终浓度40%）、1ml 10*TE buffer、1ml 1M 醋酸锂溶液，混合均匀。
0.9%（w/v）氯化钠溶液：
取0.9g氯化钠溶于去离子水中，过滤除菌。
自备：DMSO
实验步骤：
一、感受态细胞的制备
1. 活化菌种。-80 ℃保存的菌种在 YPDA 培养基平板上划线，30 ℃培养 2-4 天。
2. 挑取酵母单菌落在 YPDA 培养基平板上划 3-5 mm 的短线，30 ℃培养 2-4 天。
3. 待酵母单菌落长至直径 2-3 mm时，把酵母细胞接种到15ml无菌培养管中的 3 mL YPDA 液体培养基中，在30°C下以250 rpm摇匀孵育8-12小时。
注：设置四组单独的3ml培养管分别接种4个单独的酵母菌落，选择其中生长最快的一组进行培养，实验表明生长快的菌落往往会有更高的转化效率。
4. 将5µl菌液转移到含有50 ml YPDA的250ml培养瓶。振荡培养直至OD600达到0.15-0.3(16-20hr)。
5. 在室温下，700 g离心5分钟。丢弃上清，用100 ml新鲜的YPDA重悬沉淀。在30°C震荡培养至OD600达到0.4-0.5（3-5hr）
注：培养直到达到OD值，但不要过度培养。
6. 将培养后的培养基分成两个50ml无菌离心管中。在室温下，700 g离心5分钟。丢弃上清，在30ml无菌去离子水中重悬沉淀。
7. 在室温下，700 g离心5分钟。丢弃上清，用1.5 ml 1.1X TE/醋酸锂溶液（见实验前试剂准备步骤）重悬两份沉淀。
8. 将重悬后的细胞悬液分别转移到两个1.5 ml的微离心管中，高速离心15秒。丢弃上清，每份细胞悬液加600µl 1.1X TE/醋酸锂溶液 中重悬处理。处理后的细胞即可以进行质粒DNA的转化。
注：为了获得最好的结果，感受态细胞应该立即用于转化。
二、感受态细胞转化
准备预冷的1.5 ml/15 ml离心管，按照以下比例配置转化体系（添加顺序按照表格依次向下）：
小规模转染 1.5 ml tube | 文库转染 15 ml tube | |
Plasmid DNA （为保证效率，请使用高质量的质粒） | 100 ng | 5-15 ug1 |
鲑鱼精DNA (变性处理： 10 µg/µ）3 | 5 ul | 20 ul |
感受态细胞 （轻轻混匀） | 50 ul | 600 ul |
PEG/醋酸锂（轻轻混匀） | 500 ul | 2.5 ml |
30° C 震荡培养， | 30 min （每10 min用votex轻轻混匀） | 45 min （（每15 min用votex轻轻混匀） |
DMSO | 20 ul | 160 ul |
42° C 水浴 | 15 min （每5 min用votex轻轻混匀） | 20 min （每10 min用votex轻轻混匀） |
离心沉淀细胞，去掉上清 | 高速 15 s | 700 g，5 min |
添加YPD plus液体培养基2 | 1 ml | 3 ml |
30° C 震荡培养 | 可选 | 90 min |
离心沉淀细胞，去掉上清 | 高速 15 s | 700 g，5 min |
加0.9% 氯化钠溶液重悬细胞 | 1 ml | 15 ml |
注1：例如可使用5µg bait + 10µg prey载体进行酵母双杂交文库共转化；
注2：YPD Plus是专门为促进转化而配制的，可将效率提高50 - 100%。此步请不要使用标准YPD 培养基；
注3：为了使鲑鱼精DNA变性，可95-100°C加热 5分钟，然后在冰浴中迅速冷却。使用前再重复一次。
三、转化及效率计算
1. 将100µl的1/10和1/100稀释液涂抹在含有适当SD选择培养基的100 mm板上，30°C倒置孵育，直至出现菌落(3-5天)。培养基的选择：pGBKT7，使用SD/-Trp（CAT：Y408101）；pGADT7使用SD/-Leu（CAT：Y408104）;共转使用SD/-Leu/-Trp（CAT：Y408220）;
2. 转化效率计算：
转化效率=cfu x 悬液体积（ml）/（铺板体积（ml） x DNA 质量（ug））
若为1/10或1/100稀释液，则分别乘以10和100。
例：100ng pGBT9(试剂盒中的对照质粒)转化后，用100µl 1/10稀释液(从总的1ml中吸取)，在SD/Trp上培养3天后产生300个菌落，则转化效率为：[300 x 1/(0.1 x 0.1)】x10=3 x 105 cfu/ug。
注意事项：
1、 4°C条件下，酵母菌株在YPD或YPDA培养基中用Parafilm密封添加下可储存长达2个月。但当接种液体培养物时，新鲜菌落(1-3周)将获得更好的结果。
2、 本产品仅用于科研使用。
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