产品货号：J22202

储存条件： -20℃避光保存，尽量避免反复冻融，有效期2年。超纯水和JC-1染色缓冲液（5×）也可4℃保存。

产品描述：

    JC-1线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit）是一种以 JC-1为荧光探针，快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化的试剂盒，可以用于早期的细胞凋亡检测，也是用来检测细胞早期凋亡的常用方法。JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位△Ψm的理想荧光探针，JC-1染料以电势依赖性的方式积聚在线粒体内。正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光（Ex=585nm, Em=590nm）；不健康的线粒体由于膜电位的下降或丧失，JC-1只能以单体的形式存在于胞浆中，产生绿色荧光（Ex=514 nm, Em=529 nm）。JC-1 不仅可用于定性检测，因颜色的变化可以非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。也可以用于定量检测，因线粒体的去极化程度可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量。观察时，只需使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置即可。线粒体膜电势的破坏是细胞凋亡早期发生的一个标志性事件。细胞受到凋亡诱导后线粒体膜电位的变化使得膜的通透性发生改变。膜通透性的增加，使得线粒体蛋白包括细胞色素 C、Smac/DIABLO、HtrA2/OMI、核酸内切酶G（EndoG）、凋亡诱导因子（AIF）等从线粒体基质释放到细胞浆。细胞色素C的释放伴随膜电位的完全丧失，进而引发细胞凋亡酶的级联效应。本试剂盒提供了CCCP作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。对于六孔板中的样品，本试剂盒共可以检测100个样品；对于12孔中的样品，本试剂盒共可以检测200个样品。

使用说明：

1. JC-1染色工作液的配制

    六孔板每孔所需JC-1染色工作液的量为1 mL，其他培养器皿的JC-1染色工作液的用量以此类推；对于细胞悬液每 50～100 万细胞需 0.5 mL JC-1 染色工作液。取适量 JC-1（200x），按照每 50μL JC-1（200x）加入8 mL超纯水的比例稀释 JC-1。剧烈震荡充分溶解并混匀 JC-1。然后再加入2 mL JC-1 染色缓冲液（5x），混匀后即为 JC-1  染色工作液。

2. 阳性对照的设置

    把试剂盒中提供的CCCP（10mM）推荐按照 1：1000的比例加入到细胞培养液中， 稀释至 10uM，处理细胞20分钟。随后按照下述方法装载 JC-1，进行线粒体膜电位的检测。对于大多数细胞，通常10uM CCCP 处理20分钟后线粒体的膜电位会完全丧失，JC-1染色后观察应呈绿色荧光；而正常的细胞经JC-1染色后应显示红色荧光。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料决定或优化体系摸索最优条件。

3.对于悬浮细胞

1）取10～60万细胞，重悬于0.5 mL 细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。

2）加入 0.5 mL JC-1 染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中 37℃孵育 20 分钟。

3）在孵育期间，按照每 1 mL JC-1 染色缓冲液（5x）加入 4 mL 蒸馏水的比例，配制适量的 JC-1  染色缓冲液（1x），并放置于冰浴。

4）37℃孵育结束后，600x g 4℃离心3～4分钟，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。

5）用JC-1染色缓冲液（1x）洗涤 2 次：加入 1 mL JC-1染色缓冲液（1x）重悬细胞，600xg 4℃离心3～4分钟，沉淀细胞，弃上清。再加入 1 mL JC-1染色缓冲液（1x）重悬细胞，600xg 4℃离心3～4分钟，沉淀细胞，弃上清。

6）再用适量 JC-1 染色缓冲液（1x）重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。

4.对于贴壁细胞

对于贴壁细胞，如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。

1）对于六孔板的一个孔，吸除培养液，根据具体实验如有必要可以用 PBS 或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入1mL细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。

2）加入 1 mL JC-1 染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。

3）在孵育期间，按照每 1 mL JC-1 染色缓冲液（5x）加入4 mL蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液（1x），并放置于冰浴。

4）37℃孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液（1x）洗涤2次。

5）加入2 mL细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。

6）荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。

5.对于纯化的线粒体

1）把配制好的 JC-1 染色工作液再用 JC-1 染色缓冲液（1x）稀释 5 倍。

2）0.9 mL 5 倍稀释的JC-1染色工作液中加入 0.1 mL 总蛋白量为 10～100ug 纯化的线粒体。

3）用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描（time scan），激发波长为485 nm，发射波长为590 nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为 485 nm 时，可以在 475～520 nm 范围内设置激发波长。另外，也可以参考下面步骤6中的波长设置进行荧光检测。

4）用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：方法同下面的步骤6。

6.荧光观测和结果分析

检测 JC-1 单体时可以把激发光设置为 490 nm，发射光设置为 530 nm；

检测 JC-1 聚合物时，可以把激发光设置为 525 nm，发射光设置为 590 nm。

注意：

    此处测定荧光时不必把激发光和发射光设置在最大激发波长和最大发射波长。如使用荧光显微镜观察，检测 JC-1 聚合物时可使用常来检测碘化丙啶或者 Cy3 用的标准带通滤波器。检测 JC-1 单体可使用常来检测绿色荧光化合物如 FITC 的标准带通滤波器。出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现红色荧光说明线粒   体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。

注意事项：

1.JC-1（200x）在 4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内， 可以 20～25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。

2.必须先把 JC-1（200x）用试剂盒提供的超纯水充分溶解混匀后，才可以加入 JC-1 染色缓冲液（5x）。不可先配制 JC-1 染色缓冲液（1x）再加入 JC-1（200x），这样 JC-1 会很难充分溶解，会严重影响后续的检测。

3.装载完 JC-1 后用 JC-1 染色缓冲液（1x）洗涤时，使 JC-1 染色缓冲液（1x）保持 4℃左右，此时的洗涤效果较好。

4.JC-1 探针装载完并洗涤后尽量在 30 分钟内完成后续检测。在检测前需冰浴保存。

5.请勿把 JC-1 染色缓冲液（5x）全部配制成 JC-1 染色缓冲液（1x），本试剂盒使用过程中需直接使用 JC-1 染色缓冲液（5x）。

6.如果发现 JC-1 染色缓冲液（5x）中有沉淀，必须全部溶解后才能使用，为促进溶解可以在 37℃加热。

7.CCCP 为线粒体电子传递链抑制剂，有毒，请注意小心防护。

8.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。本品仅用于实验研究。

产品组成：