酵母单杂交（Y1H）与双杂交（Y2H）系统是研究DNA-蛋白及蛋白-蛋白相互作用的高效工具。Y1H通过将目标DNA序列克隆至报告基因上游，筛选与之结合的转录因子；Y2H则利用GAL4系统的DNA结合域与激活域分离原理，检测两个蛋白的互作关系。本protocol详细梳理了从实验设计、载体构建到酵母转化、筛选验证的完整流程。全文涵盖关键试剂货号与培养基配方，为实验操作提供标准化参考。建议收藏备用！
一、实验流程
图1 酵母杂交实验步骤
二、具体实验步骤
1.根据实验目的选择相应系统载体
| 酵母单杂（Y1H） | 酵母双杂（Y2H） |
实验目的 | 研究DNA-蛋白质之间的相互作用。 鉴定与特定DNA序列（如启动子、顺式元件）结合的转录因子。 验证已知蛋白与特定DNA片段的结合。 | 研究蛋白质-蛋白质之间的相互作用。 发现与靶蛋白（诱饵蛋白）互作的新蛋白。 验证两个推测互作蛋白间的结合。 |
基本原理 | 将目标DNA序列（“诱饵”）插入报告基因上游。当引入的转录因子（“猎物”）与之结合，激活报告基因表达。 | 将两个待测蛋白分别与转录因子的DNA结合域（BD）和转录激活域（AD）融合。只有两个蛋白互作，才能使BD和AD在空间上接近，激活报告基因。 |
质粒选择 | a. 报告质粒：含“诱饵”DNA序列和报告基因 b. 猎物质粒：表达与AD融合的转录因子（或文库）。 c. 常见系统：YIH Gold-pAbAi | a. 诱饵质粒：表达与BD融合的蛋白（如pGBKT7）。 b. 猎物质粒：表达与AD融合的蛋白或文库（如 pGADT7）。 c.常见系统：GAL4 |
2.诱饵/猎物质粒载体的构建与鉴定
杂交系统 | 诱饵质粒 | 猎物质粒 | 常用酵母菌株 （基因型特点） | 常用报告基因及筛选方式 |
酵母单杂交 (Y1H) | pAbAi 含AUR1-C基因，用于AbA抗性筛选，背景更低。 | pGADT7 表达与AD融合的转录因子（或文库），带LEU2标记。 | Y1HGold MATα, ura3, leu2, his3, trp1, gal4Δ, MEL1 | HIS3：组氨酸合成基因。在SD/-His培养基上生长，可通过添加3-AT抑制背景。 LacZ：β-半乳糖苷酶基因。使用X-α-Gal（显蓝） AbA抗性(AUR1-C)：在含金担子素A(AbA)的培养基上生长。 |
酵母双杂交 (Y2H) | pGBKT7 表达与DNA-BD融合的蛋白，带TRP1标记。 | pGADT7 表达与AD融合的蛋白（或文库），带LEU2标记。 | Y2HGold 含HIS3, ADE2, MEL1, AbAᵣ等多重报告基因
AH109 含HIS3, ADE2, LacZ报告基因 | HIS3：在SD/-His培养基上生长。 ADE2：在SD/-Ade培养基上生长。 MEL1 (LacZ)：使用X-α-Gal显色检测。 筛选时通常使用双缺/-Leu/-Trp维持质粒，三缺/-His或四缺/-His/-Ade进行筛选 |
2.1构建“诱饵-报告”质粒
通过PCR扩增包含约200-2000 bp的目标顺式调控元件，利用酶切连接（如T4连接酶，Cat：T5205）或同源重组技术（如DNA Assembly Mix Plus无缝克隆试剂，Cat：D0204P），将其克隆至不含自主启动子的报告基因（如HIS3或lacZ）上游。报告质粒通常带有URA3或TRP1筛选标记。
2.2构建“猎物”质粒
通过RT-PCR从目标组织中获取cDNA，或直接合成目的转录因子基因，将其克隆至与GAL4转录激活域（AD）融合的表达载体（如pGADT7）中，该载体携带LEU2筛选标记。
2.3鉴定
上述构建结果均需通过大肠杆菌转化（DH5α感受态细胞，Cat：DH0050）、抗生素筛选、菌落PCR、限制性酶切图谱分析及最终的DNA测序进行验证，以确保插入片段序列正确、方向无误且阅读框完整。
3.酵母菌株的活化与诱饵质粒转化
在SD/-Trp/-Ura平板（Cat：Y24048206）上划线活化酵母Y2H Gold或Y1H Gold菌株，30℃培养2-3天。挑取单菌落，在YPD(Cat：Y0002)或选择培养基中振荡培养至对数期。使用LiAc/PEG化学转化法或商业试剂盒（酵母转化试剂盒，Cat：YT0010）将诱饵质粒转化酵母。将转化混合物涂布于SD/-Trp（Cat:Y24048101）或SD/-Ura（Cat:Y24048102）筛选平板，30℃倒置培养3-5天，观察转化子生长。
4.自激活及毒性检测
将构建好的诱饵质粒（如pGBKT7-X）与空AD载体（如pGADT7）共转化酵母感受态细胞，涂布于高选择性培养基（如SD/-Leu/-Trp/-His/+3-AT或含AbA的SD/-Leu/-Trp平板）。30℃培养3-5天。若出现克隆生长或显色，表明诱饵蛋白可能自激活，需提高3-AT浓度或放弃该诱饵。在SD/-Leu/-Trp平板（Cat：Y24048220）上若菌落明显小于对照，则提示可能存在毒性，需考虑使用诱导型启动子。
5.重组质粒共转化酵母菌株
5.1共转化
在无菌条件下，将重组诱饵质粒(pGBKT7-诱饵)与重组猎物质粒(pGADT7-猎物)共转化至酵母感受态细胞（酵母转化试剂盒，Cat：YT0010）。
5.2筛选
涂布于两种关键缺陷培养基。SD/-Leu/-Trp培养基（Cat：Y24048220）用于验证质粒是否成功转入（所有转化子均应生长），而SD/-Leu/-Trp/-His/+适量3-AT培养基(Cat：Y24048323;Cat：A8056)则提供核心筛选压力，只有发生互作、激活HIS3报告基因的细胞才能生长。
5.3对照设置
为排除假阳性，实验平行设置了阳性对照（已知互作蛋白对）、阴性对照（已知不互作蛋白对）、以及分别检测诱饵与猎物自身是否激活报告基因的自激活对照。通过系统比较各组在筛选平板上的生长差异，可特异性鉴定出由目标蛋白互作产生的阳性克隆。
6.阳性克隆验证
将初筛阳性克隆点种至SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade平板(Cat：Y24048406)及SD/-Leu/-Trp对照平板（Cat：Y24048220），30℃培养3-7天。仅在两种平板上均能稳定生长的克隆，表明其蛋白互作同时激活了两个独立报告基因，可通过此高选择性压力验证，极大提高结果可靠性。
7.X-a-Gal显色验证
将待测酵母克隆点种或划线于含有X-α-Gal底物的SD/-Leu/-Trp平板上(Cat：Y24048220;Cat：X0200)。若诱饵与猎物蛋白发生相互作用，激活的LacZ报告基因编码的α-半乳糖苷酶会水解X-α-Gal，产生深蓝色产物，通常在30℃培养24-72小时内可使菌落显色。
