实验方案：

酵母单杂交系统是一种在酵母细胞内研究蛋白质与DNA相互作用的强大工具。其核心原理是：将待测的“诱饵”DNA序列（顺式作用元件）插入到报告基因（如 HIS3、LacZ、*AUR1-C* 等）上游，将待测的“猎物”蛋白质与酵母GAL4转录激活结构域（AD）融合表达。如果蛋白质能特异性结合DNA，则会招募AD并激活下游报告基因的转录，从而通过营养缺陷筛选（如-His）、显色反应（X-β-gal）或抗性筛选（金担子素A）来鉴定互作。

主要步骤：

1. 载体构建：构建“诱饵”载体（含报告基因和DNA序列）和“猎物”载体（AD-蛋白质融合表达）。

2. 酵母转化：将两种载体共转化进入合适的酵母报告菌株。

3. 互作筛选：在缺陷培养基或含抗性/显色底物的平板上筛选阳性克隆。

4. 验证与分析：通过梯度筛选、β-半乳糖苷酶活性定量等排除假阳性，确认互作特异性。

一、实验方案（Y1HGold-pAbAi 系统）

1. 载体构建

· 诱饵载体（AbAi-bait）：将目标 DNA 序列（如顺式作用元件的 1-3 个串联重复）克隆到 pAbAi 载体（含 Ura3 筛选标记），用于整合到酵母基因组并作为报告载体。

· 猎物载体（AD-prey）：将目标转录因子基因克隆到 pGADT7 载体（含 Leu2 筛选标记，表达 GAL4 激活域融合蛋白）。

2. 诱饵载体线性化与酵母转化

1. 用 BstBI 酶切 pAbAi-bait 载体使其线性化，胶回收纯化。

2. 采用醋酸锂法将线性化质粒转入 Y1HGold 感受态细胞，涂布 SD/-Ura 固体培养基，28℃培养 2-3 天，筛选整合成功的酵母克隆，通过菌落 PCR 鉴定阳性克隆

3. 自激活检测（AbA 浓度梯度筛选）

1. 挑取阳性诱饵酵母克隆，培养至 OD₆₀₀≈0.2，梯度稀释（10⁰、10⁻¹、10⁻²、10⁻³）。

2. 分别点样于含 0、100、200、500、1000 ng/mL Aureobasidin A（AbA）的 SD/-Ura 平板，28℃培养 2-3 天。

3. 确定能完全抑制诱饵菌株自激活生长的最低 AbA 浓度，用于后续筛选。

4. 猎物载体转化与互作筛选

1. 制备诱饵酵母感受态，将 AD-prey 质粒（或 pGADT7-cDNA 文库）转入，涂布 SD/-Ura/-Leu+AbA（筛选浓度）平板，28℃培养 3-5 天。

2. 挑取阳性克隆，通过梯度稀释点样（SD/-Ura/-Leu+AbA 与对照平板）验证互作特异性。

5. 阳性克隆鉴定与验证

1. 提取阳性克隆中的猎物质粒，转化大肠杆菌，测序鉴定插入的转录因子基因。

2. 回转化验证：将测序正确的质粒重新转入诱饵酵母，再次点样确认互作稳定性，排除假阳性。

二、常用酵母单杂交系统

系统名称	宿主菌株	诱饵载体	猎物载体	报告基因	筛选方式	缺陷培养基	主要用途
Y1HGoldpAbAi 系统	Y1HGold	pAbAi（基因组整合）	pGADT7 / pGADT7Rec	AUR1C	AbA 抗生素筛选（100-1000 ng/mL）	SD/-Ura SD/-Leu-Ura	cDNA 文库筛选，假阳性低，发文章首选
Y187pHis2 系统	Y187	pHis2（游离质粒）	pGADT7	HIS3	3AT 抑制（1-100 mM）	SD/-Trp-Leu-His	点对点验证，操作快，不用整合
EGY48pLacZi 系统	EGY48	pLacZi / pOP	pB42AD	LacZ	XαGal 显色（40 μg/mL）	SD/-Trp-Ura SD/-Trp-Ura-His	显色观察，定性直观，适合教学与初筛
YM4271pINT1 系统	YM4271	pINT1HIS3（整合）	pGAD424 / pACT2	HIS3	3AT 抑制（5-50 mM）	SD/-Leu-His	经典筛库系统，老文献常用，稳定性好

三、Y1HGold-pAbAi  系统筛库流程 

 

四、推荐生物试剂与耗材

类别	名称	货号
试剂盒	酵母转化试剂盒	YT0010/YT0015
培养基	SD 基础培养基	Y0006
SD液体培养基	SD/-trp with broth	Y14028101
	SD/-Ura with broth	Y14028102
	SD/-His with broth	Y14028103
	SD/-Leu with broth	Y14028104
	SD/-His-Ura with broth	Y14028201
	SD/-His-Trp with broth	Y14028202
	SD/-Trp-Ura with broth	Y14028206
	SD/-Leu-Ura with broth	Y14028207
	SD/-Met-Trp with broth	Y14028208
	SD/-Leu-Trp with broth	Y14028220
	SD/-His-Leu with broth	Y14028221
	SD/-Ade-Trp with broth	Y14028223
	YPDA 液体 / 固体培养基	BD 242820
SD固体培养基	SD/-trp with agar	Y24048101
	SD/-Ura with agar	Y24048102
	SD/-His with agar	Y24048103
	SD/-Leu with agar	Y24048104
	SD/-His-Ura with agar	Y24048201
	SD/-His-Trp with agar	Y24048202
	SD/-Trp-Ura with agar	Y24048206
	SD/-Leu-Ura with agar	Y24048207
	SD/-Met-Trp with agar	Y24048208
	SD/-Leu-Trp with agar	Y24048220
	SD/-His-Leu with agar	Y24048221
	SD/-Ade-Trp with agar	Y24048223
添加剂	X-α-Gal	X0200
	3-AT（Y187-pHis2 系统自激活抑制）	A8056-1
	鲑鱼精DNA溶液10mg/ml	D1627
	Salmon Sperm DNA鲑鱼精DNA	D1626
	金担子素 A（AbA）	C060208