产品货号：E6043-100T
储存温度：-20℃避光保存，有效期一年。
产品内容
规格 | 2-20T | 10-100T | 50-500T | 100-1000T | 开封后保存温度 |
A. 10 mM EdU | 40 µL | 200 µL | 1 mL | 2× 1 mL | -20℃ |
B. YF 488/555/594/647A Azide | 10 µL | 50 µL | 250 µL | 500 µL | -20℃，避光 |
C. 10× Click-iT EdU反应缓冲液 | 200 µL | 1 mL | 5 mL | 10 mL | 2-8℃ |
D. CuSO4 | 100 µL | 500 µL | 2× 1.25 mL | 5 mL | 2-8℃ |
E. Click-iT EdU缓冲液添加物 | 6 mg | 30 mg | 150 mg | 2 × 150 mg | 2-8℃ |
F. Hoechst 33342 | 5 µL | 25 µL | 125 µL | 250 µL | 2-8℃ |
注意：如果用于荧光显微镜检测，所能使用次数为上述各个规格的最大使用次数（针对 96 孔板培养的细胞），如 E6043S 可检测 20 个孔的样品（不同容器的具体用量可参考附表 1）；如果用于流式检测，所能使用次数为上述各个规格的最小使用次数，如 E6043S 可检测 2 个样品。
荧光光谱数据：YF 488 Azide：495/519 nm；YF 555 Azide：555/565 nm；YF 594 Azide：590/617 nm
YF 647A Azide：650/670 nm；Hoechst 33342：350/461 nm（bound to DNA）
产品介绍
细胞增殖检测是评估细胞健康程度、遗传毒性及抗肿瘤药物效果的基础实验手段。检测细胞增殖最精确的方法是BrdU法。EdU法检测试剂盒是BrdU法的革命性突破。EdU（5-乙炔基-2’-脱氧尿苷）是一种嘧啶类似物，在DNA合成期整合入DNA双链。EdU法检测基于“点击”反应，一种由铜催化的叠氮化合物和炔烃作用发生共价反应，形成共价键。
本试剂盒中，EdU含有炔烃，YF 488/555/594/647A Azide染料含有叠氮化合物。点击法的EdU标记增殖快速有效，易于使用。BrdU方法需要DNA变性（如酸变性、热变性或者用DNase消化）暴露出BrdU，从而方便BrdU抗体结合；而EdU法只需多聚甲醛固定和Triton X-100促渗就可以使检测试剂进入细胞，只需少量的叠氮化染料即可非常有效地标记出整合的EdU。
本试剂盒包含EdU法检测所需要的所有组分，可以用于体外培养细胞的增殖检测。
使用方法
实验材料（自备）
10 mM PBS, pH 7.2-7.6
4 %多聚甲醛固定液（in PBS）
促渗试剂（0.5 %Triton X-100 in PBS）
2 mg/mL 甘氨酸溶液（in ddH2O）
3 %BSA in PBS, pH 7.2-7.6
1 % BSA in PBS, pH 7.2-7.6
ddH2O
96/24/12/6 孔培养板或培养皿
荧光显微镜检测方法
1. 细胞培养
取对数生长期细胞，以每孔4×103 -1×105细胞（可根据细胞大小、生长速度以及实验处理的具体要求调整细胞数量和密
度）接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。
2. 药物处理
根据实验需要进行各种药物处理。
3. EdU标记
（1）用细胞完全培养基按一定比例稀释 EdU 溶液（组分 A）至合适浓度后加入细胞中，混匀；设置不加 EdU 处理的阴性对照组。
注：EdU 的标记浓度需根据细胞类型加以调整，建议以 10 µM 的初始浓度进行摸索。预实验中，建议设置 EdU 浓度梯度，
(2)细胞培养箱中孵育 2 h。短时间孵育(<2 h)宜采用高浓度，如:10~50 μM;长时间孵育(>24 h)宜采用低浓度， 如:1~10 μM;也可参考附表 3。
4. 细胞固定及促渗
注:对于需要做细胞表面抗原标记的实验，可以考虑在完成 EdU 孵育后，以含 3% BSA 洗涤液洗涤细胞 2 次，在细胞 固定促渗之前进行。
(1)孵育完成后，去除培养基。以 1X PBS 清洗细胞两次，每次 5 min，以除去未掺入 DNA 的 EdU 残留，贴壁不牢 的细胞可降低清洗强度。加入 50 μL 4 % 多聚甲醛固定液，室温孵育 20 min 后，去除固定液。
(2)每孔加入 50 μL 2 mg/mL 甘氨酸溶液，室温孵育 5 min，中和残留的固定液。
(3)以每孔100 μL3%BSA洗涤细胞2次。
(4)去除洗涤液，加入 100 μL 0.5 % Triton X-100，室温孵育 10 min。
5. EdU 检测
注:本参考步骤每个样本使用 100 μL 的工作液，用户可以根据自己的样本情况调整用量。
(1)配置 1× Click-iT EdU 反应缓冲液(组分 C):用 ddH2O 将组分 C 稀释 10 倍。
(2)配置 5× Click-iT EdU 缓冲液添加物(组分 E):加 300 μL 的 ddH2O 至 30 mg 的 E 组分管中(终浓度 100 mg/mL)， 混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在-20°C，可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用。 注:不同规格的组分 E 均按照此比例加 ddH2O 溶解，制备成 5× 储液备用。
(3)准备 1× Click-iT EdU 缓冲液添加物:用 ddH2O 稀释 5× Click-iT EdU 缓冲液添加物至 1×，溶液应现配现用。
(4)依据表 1 准备 Click-iT 工作液。
表 1. Click-iT 工作液
反应组分 | 单次反应所需加液体积 |
1×Click-iT EdU 反应缓冲液 | 855 μL |
CuSO4 (组分 D) | 40 μL |
YF 488A Azide(组分 B) | 5 μL |
1× Click-iT EdU 缓冲液添加物 | 100 μL |
总体积 | 1 mL |
(5)去除促渗剂，每孔 100 μL 的 3% BSA 洗涤液洗涤 2 次。
(6)每孔加入 100 μL Click-iT 工作液，均匀覆盖细胞。
(7)室温避光孵育 30 min。
(8)除去 Click-iT 工作液，以 100 μL 3% BSA 洗涤细胞 2 次后，去除洗涤液, 加入 100 μL PBS 保持细胞湿润。如 其他无特别要求，即可进行拍照分析。
6. DNA 复染(可选)
(1)用 100 μL PBS 洗涤细胞 1 次，去除洗涤液。
(2)用 PBS 将 Hoechst 33342(组分 F)稀释 2000 倍。
(3)每孔加 100 μL 1×Hoechst 33342 溶液，室温避光孵育 15-30 min。
(4)去除 Hoechst 33342 溶液，用 100 μL PBS 洗涤细胞 2 次。
7. 成像及分析建议染色完成后立即进行荧光显微镜拍照观察;如果条件限制，请于 4°C 条件下避光湿润保存 3 天之内完 成拍照。
流式细胞仪检测方法
1. 细胞培养
每孔 1×105~3×106 个细胞接种于 6 孔板中。
2. 药物处理
根据实验需要进行各种药物处理。
3. EdU 标记细胞
(1)用细胞完全培养基按一定比例稀释 EdU 溶液(组分 A)至合适浓度后加入细胞中，混匀;设置不加 EdU 处理的阴 性对照组。
注:EdU 的标记浓度需根据细胞类型加以调整，建议以 10 μM 的初始浓度进行摸索。预实验中，建议设置 EdU 浓度梯度， 可参考附表 2 和附表 3。
(2)细胞培养箱中孵育 2 h。EdU 孵育细胞的时间可以直接用作测定细胞 DNA 合成的指标，时间点选择以及孵育的时间 取决于细胞生长速率。通过短暂的 EdU 孵育进行的脉冲式标记细胞可以用于研究细胞周期动力学。 注:最佳孵育时间与细胞周期有关，大多数肿瘤细胞系均可采用 2 h 的孵育时间，可参考附表 2。EdU 浓度与孵育时间相 关，短时间孵育(<2 h)宜采用高浓度，如:10~50 μM;长时间孵育(>24 h)宜采用低浓度，如:1~10 μM;也可参考附 表 3。
4. 细胞固定及促渗
注:对于需要做细胞表面抗原标记的实验，可以考虑在完成 EdU 孵育后，以含 1 % BSA 洗涤细胞 2 次，在细胞固定促 渗之前进行。
(1)孵育完成后，收集细胞，每管加入 1 mL PBS 清洗细胞，1000 rpm 离心 5 min，吸弃上清，以除去未掺入 DNA 的 EdU 残留。
(2)每管加入 1 mL 4 % 多聚甲醛固定液重悬细胞。
(3)室温孵育 20 min，1000 rpm 离心 5 min ，吸弃上清。
(4)每管加入 1 mL 2 mg/mL 甘氨酸孵育 5min，中和残留的固定液，1000 rpm 离心 5 min，吸弃上清，每管加入 1 mL PBS 清洗 1 次，1000 rpm 离心 5 min，吸弃上清。
(5)每管加入 1mL 0.5 % Triton X-100 促渗液重悬细胞，室温孵育 10 min。
5. EdU 检测
注:针对 6 孔板样本可参考每孔 1 mL 的工作液来进行，用户可以根据自己的样本情况调整用量。
(1)配置 1× Click-iT EdU 反应缓冲液:用 ddH2O 将组分 C 稀释 10 倍。
(2)配置 5× Click-iT EdU 缓冲液添加物(组分 E):加 300 μL ddH2O 至 30 mg 的组分 E 试管中(终浓度 100 mg/mL)， 混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在-20°C，可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用。 注:不同规格的组分 E 均按照此比例加 ddH2O 溶解为 5× 储液备用。
(3)准备 1× Click-iT EdU 缓冲液添加物:以 ddH2O 稀释 5× Click-iT EdU 缓冲液添加物储液至 1×，溶液应现配现用。 (4)依据表 2 准备 Click-iT 工作液。
表 2. Click-iT 工作液
(5)1000 rpm 离 5 min，吸弃上清，去除促渗剂，每管加入 1mL 的 1% BSA 洗涤液洗涤 2 次，1000 rpm 离 5 min，吸 弃上清。
(6)每管加入 1 mL Click-iT 工作液，混匀。
(7)室温避光孵育 30 min。
(8)1000 rpm 离 5 min，吸弃染色反应液，每管加入 1% BSA 洗涤细胞 2 次，1000 rpm 离心 5min，吸弃上清，用 1 mL 1 % BSA 再次重悬细胞(重悬细胞的溶液体积可根据细胞的数量加以调整)，流式细胞仪检测。 注:如需进行其他标志物检测可参考步骤 4。
6. 细胞内抗原标记(可选步骤)
(1)加入抗体工作液，混匀。
(2)避光条件下，以合适的温度及时间孵育抗体。
7. 流式检测及分析:
(1)建议染色完成后立即进行流式检测;如果条件限制，请避光 4°C湿润保存待测，但不应超过 3 天。 (2)检测的细胞数量建议尽量能达到百万级，若细胞数量较少，检测的细胞数量可调整为十万级起始进行实验。对于细胞 得率过少(刚到万级)的情况，可能不利于做流式图，对此可适当减少步骤 5(8)中的清洗次数。
注意事项
1. 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。
2. 荧光染料均存在淬灭问题，实验操作时请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
3. Click-iT EdU 缓冲液添加物溶液最好现配现用，以保证最佳结果。
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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