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  • CHIP assay kit(agarose)(货号:CP0581)
  • CHIP assay kit(agarose)(货号:CP0581)

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    • 试剂规格:
    • 22T
CAS:
-


货号:CP0581

存储条件:4ºC保存

 

产品说明

CHIP检测试剂盒用于通过免疫沉淀来沉淀和目标蛋白结合的染色质片段,最后通过PCR或Southern等方法来检测沉淀的染色质片段的试剂盒。通常用于检测特定的转录因子或组蛋白等基因组DNA结合蛋白是否和预期的特定基因组DNA序列在同一复合物中。通过ChIP检测可以获得在体的(In Vivo)目标蛋白和预期基因组DNA片段是否在同一复合物中的结论。ChIP的检测结果则可明确说明这种结合在细胞内是真实发生的。

本ChIP检测试剂盒采用Protein A+G Agarose,比Protein A Agarose或Protein G Agarose适合于免疫沉淀更多种类的抗体, 包括mouse IgG1 ,IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, rat IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, rabbit IgG, rabbit and goat polyclonal Abs,以及human IgG1 , IgG2, IgG3和IgG4。

本试剂盒中经过Salmon Sperm DNA预饱和的Protein A+G Agarose和目的基因组DNA的非特异性结合大大下降。

      提供预混合的对照引物 (Control Primers) 。可用于扩增 human GAPDH的部分相应序列,引物序列为:5’-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3’; 5’-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3’。


产品组分:

货号

名称

规格

P0233

Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA

3*1ml

CP0581-1

Glycine Solution (10X)

30ml

CP0581-2

ChIP Dilution Buffer

48ml

CP0581-3

Low Salt Immune Complex Wash Buffer

24ml

CP0581-4

High Salt Immune Complex Wash Buffer

24ml

CP0581-5

LiCl Immune Complex Wash Buffer

24ml

CP0581-6

TE Buffer

48ml

CP0581-7

0.5M EDTA

250µl

CP0581-8

5M NaCl

500µl

CP0581-9

1M Tris, pH 6.5

500µl

CP0581-10

SDS Lysis Buffer

10ml

CP0581-11

Control Primers (5µM each)

0.1ml


操作步骤(仅供参考):

一、样品超声处理条件的优化:

1. 准备适量预冷的PBS,以及100mM PMSF。将SDS Lysis Buffer适当温浴使其中的SDS充分溶解,并混匀。

2. 将细胞培养于250px细胞培养皿中,细胞培养液的用量为10 ml。在预期发生目的蛋白和基因组DNA结合的时间直接向细胞培养液中加入适量甲醛,轻轻混匀,至最终浓度为1%。然后在37ºC孵育10分钟,以交联目的蛋白和相应的基因组 DNA。例:250px细胞培养皿中加入10ml细胞培养液的情况下需加入270ul37%甲醛。请注意尽量使用高质量、有效使用期限内的甲醛。细胞也可以培养于150px细胞培养皿中,相关溶液的用量需按照比例进行调整。

3. 加入1.1ml Glycine Solution (10X),轻轻混匀。室温放置5分钟。

4. 将有细胞样品的培养皿置于冰浴上。吸出含甲醛和glycine的培养液,尽量保持没有液体残留。

5. 室温放置5分钟,期间用预冷的PBS稀释100mM PMSF至1mM,即配制成冰浴预冷的含1mM PMSF的PBS。 PMSF水性溶液一定要新鲜配制,其在水相中的半衰期约为30min。

6. 加入5-10ml预冷的PBS(含1mM PMSF),洗涤细胞,吸尽液体,尽量保持没有液体残留。

7. 再加入5-10ml预冷的PBS(含1mM PMSF),进一步洗涤细胞,吸尽液体,尽量保持没有液体残留。

8. 加入1ml预冷的PBS(含1mM PMSF),用细胞刮子刮下细胞,收集至离心管中。如细胞可以用枪吹打下来,也可以用枪吹打。对细胞进行计数,分装成每管大约100万细胞。

9. 4ºC,800-1000g离心1-2分钟,充分沉淀细胞。如果发现沉淀不充分,可以适当延长离心时间。吸尽上清,尽量减少液体残留。

10. 配制适量含有1mM PMSF的SDS Lysis Buffer。上步骤的100万细胞沉淀用0.2ml含有1mM PMSF的SDS Lysis Buffer重悬。

11. 在冰浴上孵育10分钟,以充分裂解细胞。

12. 超声处理,以剪切基因组DNA,使DNA大部分断裂成200-1000bp大小,如能将大部分片段控制在400-800bp则更佳。超声过程中请注意要保持样品处于冰浴中保持较低温度。超声剪切的效果在后续去交联后可以用常规的DNA琼脂糖凝胶电泳检测。超声处理的条件通常可设置为10秒每次,共3-4次,功率为50W时设置为最大功率的30%,采用2mm超声头。不同的超声处理仪器的设置不太一样,摸索超声条件时,可以先固定其他条件,先确定每次超声多长时间不会导致明显发热,再摸索不同的超声次数。直至找到比较合适的超声次数可使大部分基因组DNA断裂成200-1000bp大小。需注意每次的超声体积和细胞用量宜固定,否则就不能使用一个相对比较固定的超声条件用于后续实验。   

:在对超声后基因组DNA大小进行检测时,如果采用琼脂糖凝胶点染法(即将核酸染料添加到loading buffer中的方式)或者胶染法,由于电泳时SDS会与此类染料结合形成异常条带,条带通常在500-1000bp左右,因此会对超声后基因组DNA大小的判断造成一定的影响。建议采用后染法进行条带大小的检测,使用该方法不会有异常条带出现,不影响对超声后基因组DNA大小的判断,而且条带大小更准确。

13. 在0.2ml经过超声处理的样品中加入8ul 5M NaCl,混匀。65ºC加热4小时,以去除蛋白和基因组DNA之间的交联。

14. 加入等体积的Tris平衡苯酚,vortex剧烈混匀,随后4ºC,12000g左右离心5分钟。吸取上清至另一离心管中。

15. 加入等体积氯仿,vortex剧烈混匀,随后4ºC,12000g左右离心5min。吸取上清至另一离心管中。

说明 上述步骤14和15的酚氯仿抽提可以使用DNA纯化试剂盒进行操作。

16. 取少量通过酚氯仿抽提或DNA纯化试剂盒获得的液体,对于酚氯仿抽提产物可以取5-10ul,对于DNA纯化试剂盒纯化产物可以取2-5ul,进行琼脂糖凝胶电泳,观察超声处理对于基因组DNA的剪切效果。


二、染色质免疫沉淀:

1. 在对样品超声处理条件进行优化后,对于待检测样品按照样品超声处理条件的优化1-11的步骤进行操作,并参考步骤12进行超声处理。

2. 对于经过超声处理的样品在4ºC,12000-14000g离心5min。取上清(约0.2ml)至2ml离心管中,置于冰浴。

3. 配制适量含有1mM PMSF的ChIP Dilution Buffer。加入1.8ml含有1mM PMSF的ChIP Dilution Buffer以稀释经过超声处理的样品,使最终体积为2ml。

4. 取出20ul样品作为Input用于后续检测。剩余样品加入70ul Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA,在4ºC缓慢转动或摆动混匀30min。此步骤的目的是减少Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA和目的蛋白或目的DNA序列的非特异性结合。

5. 4ºC,1000g左右离心1min,将上清转移至一个新的2ml离心管中。

6. 加入适量一抗,一抗的用量可参考抗体说明书。如果抗体的说明中未给出用于ChIP的稀释比例,可以参考普通的免疫沉淀的稀释比例。通常一抗的用量为0.5-1ug。4ºC缓慢转动或摆动混匀过夜。可以不加抗体作为阴性对照,或用无关的抗体作为阴性对照,同时可以用没有细胞样品的溶液作为空白对照。

7. 加入60ul Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA,在4ºC缓慢转动或摆动混匀 60min,以沉淀一抗识别的蛋白或相应的复合物。

8. 4ºC,1000g左右离心1min。非常小心地去除上清,切勿触及沉淀。随后依次用如下溶液对沉淀进行洗涤,每次洗涤液 的用量为1ml,每次在4ºC缓慢转动或摆动洗涤3-5min,随后4ºC,1000g左右离心1min。小心去除上清液体,切勿触 及沉淀。

(a) Low Salt Immune Complex Wash Buffer洗涤一次。

(b) High Salt Immune Complex Wash Buffer洗涤一次。

(c) LiCl Immune Complex Wash Buffer洗涤一次。

(d) TE Buffer洗涤两次。

完成上述所有洗涤步骤后所获得的沉淀即可用于PCR扩增目的基因序列或用Southern检测目的基因序列, 或者用于Western检测等。


三、PCR扩增目的基因序列(如ChIP产物用于检测目的基因序列):

1. 新鲜配制适量Elution buffer (1% SDS, 0.1M NaHCO3)。

2. 完成步骤免疫沉淀步骤8步后,即完成所有洗涤步骤后,加入250ul Elution buffer。Vortex混匀,室温转动或摆动继续洗脱3-5min。

3. 1000g左右离心1min,将上清转移到一新的离心管中。沉淀中再加入250ul Elution buffer。Vortex混匀,室温转动或摆动继续洗脱3-5min。

4. 1000g左右离心1min,取出上清。和上一步骤即步骤3中获得的上清合并。共计约500ul上清。

5. 在500ul上清中加入20ul 5M NaCl,混匀。65ºC加热4小时,以去除蛋白和基因组DNA之间的交联。对于步骤2D获得的作为Input的20ul样品,加入1ul 5M NaCl,混匀,65ºC加热4小时,同样用于去除蛋白和基因组DNA之间的交联。

此步骤完成后可以继续进行后续步骤,也可先-20ºC冻存,第二天继续后续步骤。

注1:此时的样品已经可以用于PCR,可以尝试使用1、2、5或10ul样品作为模板用于PCR检测目的基因。此时PCR的

效果和可能被沉淀下来的DNA的量,以及整个PCR扩增体系是否容易扩增目的基因有关。如果发现PCR效果欠佳,可以

考虑通过后续的纯化步骤,纯化并浓缩样品,然后再进行PCR检测。

注2:通常情况下,推荐进行后续纯化后再进行PCR检测,而Input通常不必进行后续纯化步骤。

6. 在约520ul样品中加入10ul 0.5M EDTA,20ul 1M Tris pH 6.5和1ul 20mg/ml 蛋白酶K。混匀后45ºC孵育60分钟。

7. 加入等体积Tris平衡苯酚,vortex剧烈混匀,随后4ºC,12000g左右离心5分钟。吸取上清至另一离心管中。

8. 加入等体积氯仿,vortex剧烈混匀,随后4ºC,12000g左右离心5分钟。吸取上清至另一离心管中。

9. 加入20ug glycogen或yeast tRNA,加入1/10体积的3M NaAc,pH5.2,再加入2.5倍体积无水乙醇。混匀后-70ºC沉淀不少于1小时,或-20ºC沉淀8小时以上。

10. 4ºC,12000-14000g离心10分钟,小心吸去大部分上清,切勿触及沉淀。

11. 加入约1ml 70%乙醇洗涤沉淀。4ºC,12000-14000g离心10min,小心吸去大部分上清,切勿接触沉淀。

12. 4ºC,12000-14000g离心1min,小心吸除残留液体。

13. 用少量TE或水重悬DNA沉淀,用于目的基因的PCR检测。用于PCR的引物最好能设计2组,可以用Input作为模板预先摸索出相应的PCR条件,并选择一组效果较好的引物用于最终的PCR检测。少数情况下,当PCR条带过弱时,可以采用nested PCR技术,进行两轮扩增。

:步骤7至步骤13也可以采用适当的DNA纯化试剂盒纯化DNA。


四、 Western检测ChIP产物(如果ChIP产物用于Western检测):

1. 接步骤染色质免疫沉淀第8步,在完成所有的洗涤步骤后,加入25ul SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X)。SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X)可以用SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)用水稀释配制而成。沸水浴煮沸10分钟。

2. 取10-20ul用于Western检测。

 

注意事项:

1、请勿冷冻保存CP0591-1:Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA。其它溶液可以-20ºC冷冻以保存更长时间。

2、需自备用于ChIP的一抗,37%甲醛,PBS,PMSF,Elutioin (1% SDS, 0.1M NaHCO3),蛋白酶K,Glycogen或tRNA,Tris平衡苯酚,氯仿,95%乙醇,70%乙醇,3M NaAc (pH5.2)以及细胞刮子或细胞铲子。

3、需自备超声样品处理仪(sonicator),也称超声粉碎机或超声细胞粉碎机。

4、使用甲醛时请在通风橱中进行操作。

5、本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

6、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。


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