货号：CP0581

存储条件：4ºC保存

产品说明

CHIP检测试剂盒用于通过免疫沉淀来沉淀和目标蛋白结合的染色质片段，最后通过PCR或Southern等方法来检测沉淀的染色质片段的试剂盒。通常用于检测特定的转录因子或组蛋白等基因组DNA结合蛋白是否和预期的特定基因组DNA序列在同一复合物中。通过ChIP检测可以获得在体的(In Vivo)目标蛋白和预期基因组DNA片段是否在同一复合物中的结论。ChIP的检测结果则可明确说明这种结合在细胞内是真实发生的。

本ChIP检测试剂盒采用Protein A+G Agarose，比Protein A Agarose或Protein G Agarose适合于免疫沉淀更多种类的抗体， 包括mouse IgG1 ，IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, rat IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, rabbit IgG, rabbit and goat polyclonal Abs，以及human IgG1 , IgG2, IgG3和IgG4。

本试剂盒中经过Salmon Sperm DNA预饱和的Protein A+G Agarose和目的基因组DNA的非特异性结合大大下降。

      提供预混合的对照引物 (Control Primers) 。可用于扩增 human GAPDH的部分相应序列，引物序列为：5’-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3’； 5’-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3’。

产品组分：

操作步骤（仅供参考）：

一、样品超声处理条件的优化：

1. 准备适量预冷的PBS，以及100mM PMSF。将SDS Lysis Buffer适当温浴使其中的SDS充分溶解，并混匀。

2. 将细胞培养于250px细胞培养皿中，细胞培养液的用量为10 ml。在预期发生目的蛋白和基因组DNA结合的时间直接向细胞培养液中加入适量甲醛，轻轻混匀，至最终浓度为1%。然后在37ºC孵育10分钟，以交联目的蛋白和相应的基因组 DNA。例：250px细胞培养皿中加入10ml细胞培养液的情况下需加入270ul37%甲醛。请注意尽量使用高质量、有效使用期限内的甲醛。细胞也可以培养于150px细胞培养皿中，相关溶液的用量需按照比例进行调整。

3. 加入1.1ml Glycine Solution (10X)，轻轻混匀。室温放置5分钟。

4. 将有细胞样品的培养皿置于冰浴上。吸出含甲醛和glycine的培养液，尽量保持没有液体残留。

5. 室温放置5分钟，期间用预冷的PBS稀释100mM PMSF至1mM，即配制成冰浴预冷的含1mM PMSF的PBS。 PMSF水性溶液一定要新鲜配制，其在水相中的半衰期约为30min。

6. 加入5-10ml预冷的PBS（含1mM PMSF），洗涤细胞，吸尽液体，尽量保持没有液体残留。

7. 再加入5-10ml预冷的PBS（含1mM PMSF），进一步洗涤细胞，吸尽液体，尽量保持没有液体残留。

8. 加入1ml预冷的PBS（含1mM PMSF），用细胞刮子刮下细胞，收集至离心管中。如细胞可以用枪吹打下来，也可以用枪吹打。对细胞进行计数，分装成每管大约100万细胞。

9. 4ºC，800-1000g离心1-2分钟，充分沉淀细胞。如果发现沉淀不充分，可以适当延长离心时间。吸尽上清，尽量减少液体残留。

10. 配制适量含有1mM PMSF的SDS Lysis Buffer。上步骤的100万细胞沉淀用0.2ml含有1mM PMSF的SDS Lysis Buffer重悬。

11. 在冰浴上孵育10分钟，以充分裂解细胞。

12. 超声处理，以剪切基因组DNA，使DNA大部分断裂成200-1000bp大小，如能将大部分片段控制在400-800bp则更佳。超声过程中请注意要保持样品处于冰浴中保持较低温度。超声剪切的效果在后续去交联后可以用常规的DNA琼脂糖凝胶电泳检测。超声处理的条件通常可设置为10秒每次，共3-4次，功率为50W时设置为最大功率的30%，采用2mm超声头。不同的超声处理仪器的设置不太一样，摸索超声条件时，可以先固定其他条件，先确定每次超声多长时间不会导致明显发热，再摸索不同的超声次数。直至找到比较合适的超声次数可使大部分基因组DNA断裂成200-1000bp大小。需注意每次的超声体积和细胞用量宜固定，否则就不能使用一个相对比较固定的超声条件用于后续实验。   

注：在对超声后基因组DNA大小进行检测时，如果采用琼脂糖凝胶点染法（即将核酸染料添加到loading buffer中的方式）或者胶染法，由于电泳时SDS会与此类染料结合形成异常条带，条带通常在500-1000bp左右，因此会对超声后基因组DNA大小的判断造成一定的影响。建议采用后染法进行条带大小的检测，使用该方法不会有异常条带出现，不影响对超声后基因组DNA大小的判断，而且条带大小更准确。

13. 在0.2ml经过超声处理的样品中加入8ul 5M NaCl，混匀。65ºC加热4小时，以去除蛋白和基因组DNA之间的交联。

14. 加入等体积的Tris平衡苯酚，vortex剧烈混匀，随后4ºC，12000g左右离心5分钟。吸取上清至另一离心管中。

15. 加入等体积氯仿，vortex剧烈混匀，随后4ºC，12000g左右离心5min。吸取上清至另一离心管中。

说明： 上述步骤14和15的酚氯仿抽提可以使用DNA纯化试剂盒进行操作。

16. 取少量通过酚氯仿抽提或DNA纯化试剂盒获得的液体，对于酚氯仿抽提产物可以取5-10ul，对于DNA纯化试剂盒纯化产物可以取2-5ul，进行琼脂糖凝胶电泳，观察超声处理对于基因组DNA的剪切效果。

二、染色质免疫沉淀：

1. 在对样品超声处理条件进行优化后，对于待检测样品按照样品超声处理条件的优化中1-11的步骤进行操作，并参考步骤12进行超声处理。

2. 对于经过超声处理的样品在4ºC，12000-14000g离心5min。取上清(约0.2ml)至2ml离心管中，置于冰浴。

3. 配制适量含有1mM PMSF的ChIP Dilution Buffer。加入1.8ml含有1mM PMSF的ChIP Dilution Buffer以稀释经过超声处理的样品，使最终体积为2ml。

4. 取出20ul样品作为Input用于后续检测。剩余样品加入70ul Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA，在4ºC缓慢转动或摆动混匀30min。此步骤的目的是减少Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA和目的蛋白或目的DNA序列的非特异性结合。

5. 4ºC，1000g左右离心1min，将上清转移至一个新的2ml离心管中。

6. 加入适量一抗，一抗的用量可参考抗体说明书。如果抗体的说明中未给出用于ChIP的稀释比例，可以参考普通的免疫沉淀的稀释比例。通常一抗的用量为0.5-1ug。4ºC缓慢转动或摆动混匀过夜。可以不加抗体作为阴性对照，或用无关的抗体作为阴性对照，同时可以用没有细胞样品的溶液作为空白对照。

7. 加入60ul Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA，在4ºC缓慢转动或摆动混匀 60min，以沉淀一抗识别的蛋白或相应的复合物。

8. 4ºC，1000g左右离心1min。非常小心地去除上清，切勿触及沉淀。随后依次用如下溶液对沉淀进行洗涤，每次洗涤液 的用量为1ml，每次在4ºC缓慢转动或摆动洗涤3-5min，随后4ºC，1000g左右离心1min。小心去除上清液体，切勿触 及沉淀。

(a) Low Salt Immune Complex Wash Buffer洗涤一次。

(b) High Salt Immune Complex Wash Buffer洗涤一次。

(c) LiCl Immune Complex Wash Buffer洗涤一次。

(d) TE Buffer洗涤两次。

注： 完成上述所有洗涤步骤后所获得的沉淀即可用于PCR扩增目的基因序列或用Southern检测目的基因序列， 或者用于Western检测等。

三、PCR扩增目的基因序列(如ChIP产物用于检测目的基因序列)：

1. 新鲜配制适量Elution buffer (1% SDS, 0.1M NaHCO3)。

2. 完成步骤免疫沉淀步骤第8步后，即完成所有洗涤步骤后，加入250ul Elution buffer。Vortex混匀，室温转动或摆动继续洗脱3-5min。

3. 1000g左右离心1min，将上清转移到一新的离心管中。沉淀中再加入250ul Elution buffer。Vortex混匀，室温转动或摆动继续洗脱3-5min。

4. 1000g左右离心1min，取出上清。和上一步骤即步骤3中获得的上清合并。共计约500ul上清。

5. 在500ul上清中加入20ul 5M NaCl，混匀。65ºC加热4小时，以去除蛋白和基因组DNA之间的交联。对于步骤2D获得的作为Input的20ul样品，加入1ul 5M NaCl，混匀，65ºC加热4小时，同样用于去除蛋白和基因组DNA之间的交联。

此步骤完成后可以继续进行后续步骤，也可先-20ºC冻存，第二天继续后续步骤。

注1：此时的样品已经可以用于PCR，可以尝试使用1、2、5或10ul样品作为模板用于PCR检测目的基因。此时PCR的

效果和可能被沉淀下来的DNA的量，以及整个PCR扩增体系是否容易扩增目的基因有关。如果发现PCR效果欠佳，可以

考虑通过后续的纯化步骤，纯化并浓缩样品，然后再进行PCR检测。

注2：通常情况下，推荐进行后续纯化后再进行PCR检测，而Input通常不必进行后续纯化步骤。

6. 在约520ul样品中加入10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris pH 6.5和1ul 20mg/ml 蛋白酶K。混匀后45ºC孵育60分钟。

7. 加入等体积Tris平衡苯酚，vortex剧烈混匀，随后4ºC，12000g左右离心5分钟。吸取上清至另一离心管中。

8. 加入等体积氯仿，vortex剧烈混匀，随后4ºC，12000g左右离心5分钟。吸取上清至另一离心管中。

9. 加入20ug glycogen或yeast tRNA，加入1/10体积的3M NaAc，pH5.2，再加入2.5倍体积无水乙醇。混匀后-70ºC沉淀不少于1小时，或-20ºC沉淀8小时以上。

10. 4ºC，12000-14000g离心10分钟，小心吸去大部分上清，切勿触及沉淀。

11. 加入约1ml 70%乙醇洗涤沉淀。4ºC，12000-14000g离心10min，小心吸去大部分上清，切勿接触沉淀。

12. 4ºC，12000-14000g离心1min，小心吸除残留液体。

13. 用少量TE或水重悬DNA沉淀，用于目的基因的PCR检测。用于PCR的引物最好能设计2组，可以用Input作为模板预先摸索出相应的PCR条件，并选择一组效果较好的引物用于最终的PCR检测。少数情况下，当PCR条带过弱时，可以采用nested PCR技术，进行两轮扩增。

注：步骤7至步骤13也可以采用适当的DNA纯化试剂盒纯化DNA。

四、 Western检测ChIP产物(如果ChIP产物用于Western检测)：

1. 接步骤染色质免疫沉淀第8步，在完成所有的洗涤步骤后，加入25ul SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X)。SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X)可以用SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)用水稀释配制而成。沸水浴煮沸10分钟。

2. 取10-20ul用于Western检测。

注意事项：

1、请勿冷冻保存CP0591-1:Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA。其它溶液可以-20ºC冷冻以保存更长时间。

2、需自备用于ChIP的一抗，37%甲醛，PBS，PMSF，Elutioin (1% SDS, 0.1M NaHCO3)，蛋白酶K，Glycogen或tRNA，Tris平衡苯酚，氯仿，95%乙醇，70%乙醇，3M NaAc (pH5.2)以及细胞刮子或细胞铲子。

3、需自备超声样品处理仪(sonicator)，也称超声粉碎机或超声细胞粉碎机。

4、使用甲醛时请在通风橱中进行操作。

5、本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

6、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。