货号：P1233

存储条件：4ºC保存，两年有效，长期保存可放-20℃。

产品简介

Protein A/G Magnetic Beads，也称Protein A/G免疫磁珠、Protein A/G免疫沉淀磁珠、SPA/G磁珠、蛋白A/G磁珠、蛋白A/G免疫磁珠或蛋白A/G免疫沉淀磁珠，是由高质量的重组Protein A、G与纳米级氨基磁珠共价偶联而成，可特异性地结合相应抗体，主要用于免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)、免疫共沉淀(Co-IP)或染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, Ch-IP)，也可以用于血清、细胞培养上清液或腹水等样品中抗体的纯化等。Protein A/G磁珠适合于免疫沉淀所有Protein A磁珠和Protein G磁珠单独可以免疫沉淀的抗体，包括human IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，mouse IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，rat IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、rabbit、goat等多克隆抗体。

使用说明：

1. 样品的制备。

a. 使用LABLEAD R1090 ripa中（适用于胞浆蛋白） 或者 R1091 ripa强（适用于膜蛋白和核蛋白）用于细胞或组织样品的裂解。根据特定的实验目的，选择合适的裂解液用于样品的制备。如果使用自行配制的或其它公司生产的裂解液，需要确保裂解液的pH为6-8。

b. 具体的细胞或组织样品裂解的制备步骤可参考裂解液的使用说明。制备好的裂解液上清宜置于冰上或4ºC存放，随后即可用于免疫沉淀或免疫共沉淀、标签蛋白的纯化等操作。新鲜制备好的样品，建议尽量当天完成免疫沉淀等后续操作，如样品不能当天使用，也可以适当分装后-80ºC冻存。

2. Protein A/G磁珠的准备。

由于Protein A/G磁珠储存在特殊保护液中，所以需要在加入样品前适当洗涤。

a. 用移液器轻轻吹打重悬Protein A/G磁珠，按照每500μl样品10μl或25μl磁珠悬浊液，取适量Protein A/G磁珠至一洁净离心管中，加入1X TBS 或者裂解液至最终体积为约0.5ml。

说明：a.初始体积大于0.2ml，可以直接置于磁力架上分离10秒，去除上清，然后再加入1X TBS或者裂解液 至最终体积为约0.5ml。

b. 用移液器轻轻吹打重悬Protein A/G磁珠。置于磁力架上分离10秒，去除上清。重复上述步骤两次。

c. 按照初始体积的量，用1X TBS或者裂解液 重悬Protein A/G磁珠。

3. 抗体与Protein A/G磁珠的结合。

a. 抗体的准备：按抗体使用说明中推荐的稀释比例用TBS稀释抗体，配制成抗体工作液；或将抗体配制成终浓度5-50μg/ml的抗体工作液。置于冰上备用。

可选做：使用抗体种属相同的正常IgG配制相同稀释比或终浓度的正常IgG工作液，以用于去除非特异性结合或作为阴性对照。此处种属相同的正常IgG是指：后续免疫沉淀时用的抗体是小鼠IgG，则在本步骤中可以用TBS稀释适量的normal mouse IgG以用于降低背景或作为阴性对照。

b. 抗体吸附：将步骤2准备好的Protein A/G磁珠进行磁性分离，吸除上清，加入500μl抗体工作液或正常IgG工作液（两组可同时做），重悬后在室温翻转混合仪上翻转孵育15分钟-1小时。注：也可以直接在步骤2的Protein A/G磁珠中加入适量抗体或正常IgG进行孵育。 

c. 洗涤：加入500μl的1X TBS或者裂解液，用移液器轻轻吹打重悬Protein A/G磁珠。置于磁力架上分离10秒，去除上清。重复洗涤三次。按照初始体积的量，用1X TBS或者裂解液重悬Protein A/G磁珠。注：孵育和洗涤过程中磁珠发生聚团或呈片状属正常现象，不会影响实验结果。

4. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP):

a. 去除非特异性结合(选做)：步骤3中准备的结合了正常IgG的Protein A/G磁珠与样品4ºC孵育1小时后磁性分离，上清样品用于后续实验。此步骤的目的是去除与正常IgG产生非特异性结合的蛋白。

b. 样品与结合了抗体或正常IgG的Protein A/G磁珠（可同时做两组）孵育。按照每500μl蛋白样品加入10μl或25μl磁珠悬浊液的比例加入结合了抗体或正常IgG的Protein A/G磁珠，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育2小时或4ºC孵育过夜。

注1：孵育过程中，磁珠发生聚团或呈片状属正常现象，不会影响实验结果。

注2：也可先将适量抗体或正常IgG与样品室温孵育1-2小时或4ºC孵育过夜后，再加入10-20μl磁珠悬浊液室温孵育1小时。

c. 磁分离。孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，去除上清。注：可保留部分上清液，用于检测免疫沉淀的效果。

d. 洗涤。加入500μl的1X TBS或者裂解液，用移液器轻轻吹打重悬磁珠。置于磁力架上分离10秒，去除上清。此步骤重复三次。注：也可以通过检测洗涤得到的洗涤液的OD280来判断是否洗涤完全，若OD280大于0.05，应适当增加洗涤次数。

5. 洗脱：

根据目的蛋白的特点及后续实验要求，可以选择如下方法之一进行洗脱。

酸性洗脱法：此方式为非变性法，比较快速且高效。洗脱后的蛋白维持生物活性，便于后续分析检测，如质谱检测或者酶活分析。

(a) 溶液的配制：酸性洗脱液(0.1M 甘氨酸, pH2.5)，中和液(1M Tris-HCl, pH10.1, 1.5M NaCl)。

(b) 每10-25μl原始磁珠体积，加入50μl酸性洗脱液，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育5分钟。

注：孵育时间不宜超过15分钟。洗脱液的体积可以酌情适当调整，同时须注意后续的中和液体积也需要作相应调整。

(c) 孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，将上清转移到新的离心管中，并立刻加入5μl中和液，适当混匀。

(d) 为了获得最大的洗脱效率，可重复步骤b和c，并将相同样品合并。

(e) 洗脱并中和的目的蛋白置于4ºC待用，或者-20ºC或-80ºC长期保存。

注：由于目的蛋白的差异可能对酸性洗脱法的洗脱效率有一定的影响，如洗脱效率不太高，可对酸性洗脱液的pH在2.5-3.1之间进行一定的调整，相应的中和液的pH值或量也要进行一定的调整，例如50μl酸性洗脱液(0.1M 甘氨酸, pH2.8)和10μl中和液(1M Tris-HCl, pH8.5)。

变性洗脱：本方法为变性法，得到的蛋白样品适合SDS-PAGE电泳或Western检测。

每10-25μl原始磁珠体积的磁珠，加入100μl 1X SDS-PAGE上样缓冲液，95ºC加热5分钟。注：洗脱液的体积可以酌情适当调整。置于磁力架上分离10秒，取上清进行SDS-PAGE电泳或Western检测。

竞争洗脱法：如果目的蛋白是标签蛋白，并使用相应的标签抗体进行免疫沉淀，则可使用相应的多肽进行竞争洗脱。本方法为非变性法，洗脱效率高，且洗脱后的蛋白保持原有的生物活性，便于后续分析检测。

6. 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP):

参考免疫沉淀的方法进行，但免疫共沉淀(Co-IP)通常宜使用未经冻存的新鲜蛋白样品，以确保蛋白复合物不会因为冻融而

被破坏。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品，但通常使用新鲜的蛋白样品更佳。

7. 抗体的纯化：

a. 参照步骤3，把Protein A/G磁珠加入到待纯化的抗体样品中，混匀后室温侧摆摇床或旋转混合仪上孵育1小时。吸去上清，然后用1X TBS或者裂解液洗涤3次。

b. 参照步骤5中酸洗脱方式，用适量酸性洗脱液进行洗脱，并用中和液进行中和。

c. 如上柱纯化抗体可参考一下方式：

c1准备工作：

(a) 用0.45um或0.2um孔径的滤膜过滤所用的溶液。

(b) 所有的溶液必须用超声等方法脱气(degas)。

(c) 选择适当的纯化柱，用适当量的Protein A/G Agarose装填纯化柱。也可使用LABLEAD的预装柱产品。

(d) 用10-20倍柱体积的TBS洗涤并平衡纯化柱，流速可以用恒流泵控制为1ml/min (1ml预装柱)。如无恒流泵，也可以完全依靠重力洗涤并平衡纯化柱。

c2抗体纯化：

(a) 把含有待纯化的抗体上样到纯化柱。

(b) 待纯化的抗体过柱后，用10-20倍柱体积的TBS洗涤，以去除未结合和非特异性结合的蛋白。洗涤是否完全可以通过测定280nm的吸光度进行确定。

(c) 洗涤完后，用10ml 50mM glycine，pH2.7作为洗脱液，洗脱结合的抗体。某些抗体和Protein A/G的结合能力很强，在pH2.7时洗脱效果不太理想，可以使用50mM glycine，pH1.9作为洗脱液。分管收集洗脱下的抗体，根据蛋白浓度或后续的检测效果确定洗脱峰在哪几个收集管中。

c3纯化柱的再生：

(a) 用10-20倍柱体积的TBS洗涤纯化柱，使纯化柱达到中性的pH。

(b) 用TBS来保存再生的纯化柱。