货号：T5206
保存：-20℃保存。
规格：500U
组成：
组分 | 规格 |
T4 Polynucleotide Kinase (10 U/μl) | 50ul |
10× T4 PNK Buffer | 1ml |
产品简介
T4 Polynucleotide Kinase（简称 T4 PNK），中文名称 T4 多聚核苷酸激酶，是一种多聚核苷酸5'-羧基激酶，能够催化ATP的 γ 磷酸基团转移到寡核苷酸链（双链或单链DNA 或者 RNA）或3'-单磷酸核苷上的5'-羟基末端，且该反应过程可逆。此外，T4 PNK还具有3'磷酸酶活性，可以将3'-磷酸基团从寡核苷酸的3'-磷酸末端、脱氧3'-单磷酸核苷和脱氧3'-二磷酸核苷上水解掉。
活性定义
1 活性单位 (U) 定义为在 1× T4 PNK Buffer 中，37℃、30 min 内使 1 nmol 的 [γ-32 P] ATP 掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量。
产品应用
1. 对 DNA 或 RNA 5' 末端进行磷酸化，以便进行连接反应。
2. DNA 或 RNA 的末端标记，用作探针和进行 DNA 测序。
3. 除去 3' 磷酸基团。
质量控制
蛋白纯度
经 SDS-PAGE 凝胶电泳检测，蛋白纯度不低于 95%。
非特异性内切酶活性
37℃下，在 20 μl 反应体系中将 10 U T4 Polynucleotide Kinase 与200 ng超螺旋质粒DNA 共同温育 4 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测， 少于20%的质粒DNA 转变成缺刻或线性状态。
DNase 活性
37℃下，在 20 μl 反应体系中将 10 U T4 Polynucleotide Kinase与15 ng 双链DNA 片段共同温育 16 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，双链DNA 片段无变化。
RNase 活性
37℃下，在 10 μl 反应体系中将 10 U T4 Polynucleotide Kinase 与500 ng RNA共同温育 1 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，超过 90%RNA 保持完整。
宿主 DNA 残留
采用中国药典 2020 版四部通则 3407 外源性 DNA 残留量测定法第三法定量PCR 法，本品中大肠杆菌宿主细胞 DNA 残留量低于 1 拷贝/10 U。
使用方法
1. DNA 5' 末端磷酸化：
试剂 | 使用量 |
底物 | 1~300 pmol (5' 末端 ) |
10× T4 PNK Buffera | 5 μl |
T4 Polynucleotide Kinase | 1 μl |
ATP (10 mM) | 5 μl |
ddH2O | Up to 50 μl |
a. 10 × T4 PNK Buffer 不含 ATP，需自行准备。
①将上述体系充分混匀后，37℃温育 30 min；
②反应完成后，75℃温育 10 min 使 T4 Polynucleotide Kinase 失活。
2. DNA 5' 末端标记：
试剂 | 使用量 |
底物 | 1~50 pmol (5' 末端 ) |
10× T4 PNK Bufferb | 5 μl |
T4 Polynucleotide Kinase | 2 μl |
[γ-32P]ATP (10 mM) | 0.25 μl |
ddH2O | Up to 50 μl |
b. 10× T4 PNK Buffer 不含放射性标记的 ATP ，需自行准备。
①将上述体系充分混匀后，37℃温育30 min；
②反应完成后，75℃温育 10 min 使 T4 Polynucleotide Kinase 失活。
注意事项
1. 金属离子螯合剂、磷酸盐、铵根离子、大于 50 mM 的 KCl 和 NaCl 均可显著抑制 T4 Polynucleotide Kinase 的活性。
2. 聚乙二醇 (PEG) 和亚精胺可改善磷酸化反应的速率和效率。
3. 提高 ATP 的浓度可让缺口磷酸化。切刻位点不能有效地磷酸化。CTP、GTP、TTP、UTP、dATP 及 dTTP 均可以替代 ATP 作为磷酸供体。
4. T4 Polynucleotide Kinase 使用时宜置于冰上，使用完毕后立即放置于-20℃保存。
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