货号：DR076

储存条件：-20℃保存，有效期1年以上。

①将 B 组分溶解到 A 组分后，该混合液不可反复冻融，建议进行小批量分装，并于-20℃(最长可储存 1 个月)或-80℃（最长可储存 1 年）储存。

②海肾萤光素酶缓冲液（C+D）应新鲜配制，当天使用。

产品组分：

产品描述

双萤光素酶报告基因检测试剂盒(Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit)，是先以萤光素(luciferin)为底物来检测萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)，后以肠腔素(coelenterazine)为底物来检测海肾萤光素酶(Renilla luciferase)，并且在后续加入海肾萤光素酶底物时，同时加入抑制萤火虫荧光素酶催化luciferin发光的物质，使后续检测仅仅检测到海肾萤光素酶的活性，实现双萤光素酶报告基因检测。萤火虫萤光素酶是一种分子量约为61kD的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物萤光(bioluminescence)。海肾萤光素酶是一种分子量约为36kD的蛋白，在氧气存在的条件下，可以催化coelenterazine氧化成coelenteramide，在coelenterazine氧化的过程中也会发出生物萤光。生物萤光可通过化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪进行测定。

双萤光素酶报告基因检测试剂盒为检测基因的表达量提供有效的手段，在DLR检测中，萤火虫萤光素酶（Firefly luciferase）和海肾萤光素酶（Renilla luciferase）的活性可在单个样品中依次检测。先以萤光素（Luciferin）为底物来检测萤火虫萤光素酶的活性，然后加入抑制萤火虫萤光素酶催化的物质，同时加入腔肠素（Coelenterazine）检测海肾萤光素酶的活性，实现双萤光素酶报告基因检测。通过萤光素酶和其底物这一生物发光体系，可以非常灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣基因的转录调控元件或 5' 启动子区克隆在Luciferase 的上游，或把3'-UTR 区克隆在Luciferase 的下游，构建成报告基因（Reporter gene）质粒，然后转染细胞，用适当药物等处理细胞后裂解细胞，通过检测萤光素酶活性的高低来判断药物处理等对目的基因的转录调控作用。海肾萤光素酶更多地被用作检测转染效率的内参，以消除细胞数量和转染效率的差异。萤火虫萤光素酶催化luciferin发光的最强发光波长为560nm。海肾萤光素酶催化coelenterazine发光的最强发光波长为465nm。

本试剂盒为辉光型产品，发光信号更稳定性，为实验设计提供了更大的灵活性；无需依赖自动进样器，并且无需弃培养液、离心等步骤，大大的简化了实验流程；无明显刺激性气味。本试剂盒可用于多种常用细胞培养液：RPMI 1640、DMEM 、MEM-α、F12、DMEM/F12等，其半衰期均为2h左右（22℃），满足绝大多数高通量实验需求。试剂盒光信号可以通过化学发光仪、酶标仪或液闪测定仪进行测定。

注意事项:

（1）为取得最佳测定效果，在用单管的化学发光仪测定时， 样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制一致；使用具有化学发光测定功能的多功能荧光酶标仪时，宜先把样品全部加好，然后统一加入萤火虫萤光素酶检测试剂。

（2）由于温度对酶反应有影响，所以测定时，样品和试剂均需达到室温后再进行测定。

（3）检测板：为防止孔间干扰，推荐使用不透光细胞培养白板；检测设置：Luminescence，350-700 nm，建议读板时间设为 0.5-1 sec。

（4）本产品仅限于专业人员用于生命科学研究，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，

（5）本产品必须由合格专业技术人员操作同时佩戴口罩/手套/实验服并遵守生物实验室安全操作规程！

使用方法：

自备的材料：单/多道移液器；不透光细胞培养白板；化学发光仪或带化学发光检测模块的酶标仪。

1.检测试剂准备

1）萤火虫萤光素酶检测试剂：首次使用时将2mg 组份B 虫荧光素酶底物 溶解在200ul 超纯水中配置为储存液。储存液-20℃可以储存 6 个月反复冻融 5 次。取适量储存液用萤火虫萤光素酶缓冲液（辉光型）按照 1:50 稀释配制成 0.2 mg/ml 的萤火虫萤光素酶工作液，充分混匀直至底物完全溶解。按使用需求分装，建议-70℃长期保存或-20℃保存不超过一个月。

2）海肾萤光素酶检测试剂：将400ug 海肾荧光素底物溶解到200ul乙醇中配置成2mg/ml的储存液，根据实际使用量，以 50:1 的比例将适量的海肾萤光素酶缓冲液（辉光型）与海肾萤光素酶底物储存液混匀配置工作液，室温避光备用（例如：如果需要 100 mL 缓冲液，则需要加入1 mL的底物），建议现配现用，最长3小时内使用完。

注：两种缓冲液都可以 4℃，室温或水浴融化，但温度不能超过 25℃。海肾萤光素酶底物(辉光型)，每次开盖前需进行短暂低速离心。

2.操作步骤

2.1从细胞培养箱中取出含哺乳动物细胞的培养板，放置 5-15 min，平衡至室温。

2.2萤火虫萤光素酶活性检测：

①加入与待测细胞培养液等体积并平衡至室温的萤火虫萤光素酶工作液检测试剂（例如，96孔板建议加入80μL培养液，相应加入80μL 检测试剂；384孔板通常加入20μL培养液，相应加入20μL检测试剂）。

②在水平摇床上室温混匀至少 10 min。（注：不要用移液器吹吸混匀，产生的气泡会影响发光检测读数。）

③在化学发光检测仪或带化学发光模块的多功能酶标仪上检测萤火虫萤光素酶发光信号，加入检测试剂后 2 h 内完成检测。

2.3海肾萤光素酶活性检测：

①加入平衡至室温的海肾萤光素酶工作液检测试剂，加样体积与初始细胞培养液体积相同并充分混匀。（例如，96 孔板建议加入80μL 培养液，相应加入 80μL 检测试剂；384 孔板通常加入20μL培养液，相应加入 20μL 检测试剂）。

②在水平摇床上室温混匀至少 10 min。

③在化学发光检测仪或带化学发光模块的多功能酶标仪上检测海肾萤光素酶发光信号，加入检测试剂后2 h内完成检测。海肾萤光素酶在微孔板上的检测顺序应与萤火虫萤光素酶的检测顺序相同。

4）数据分析：

①实验设计：根据不同实验目的，在每个培养板中都应设置空白对照组，实验组和对照组。

a.空白对照组

背景F：未转染细胞+萤火虫萤光素酶检测试剂。

背景R：未转染细胞+萤火虫萤光素酶检测试剂+海肾萤光素酶检测试剂。

注：用于空白对照组样品量必须与实验样品量相同，并且包含与实验样品相同的培养基/血清组合。

b.实验组：转染细胞经实验化合物处理(即实验组F和实验组R)。

c.对照组：转染细胞不经处理，用以标准化结果(即对照组F和对照组R)。

②计算结果：实验组比值=(实验组F-背景F）/(实验组R-背景R)，对照组比值=(对照组F-背景F）/(对照组R-背景R)。

表达倍数=实验组比值/对照组比值。