货号：D0205P

存储温度 ：-20°C 

产品组分

产品简介

基于重组原理的无缝克隆技术，作为新一代的克隆方法，不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平等操作，依 据  DNA  片段与线性化载体末端的  15~25 nt  同源序列的重组 ，可将插入片段克隆至任意载体的任意位点，载体自连背景 极低 ，是一种简单、快速、高效的 DNA 定向克隆技术。

DNA Assembly Mix Single Plus 无缝克隆试剂盒，专为单片段优化，最快仅需5 分钟即可完成单片段  重组 ，且阳性率高于95%。DNA Assembly Mix Single Plus  相较于  DNA Assembly Mix Plus (Cat:D0204P) ，不依赖连接酶，组分更简单，对未纯化的  PCR 产物兼容性更强。同时，由于不含连接酶，依靠大肠杆菌本身的修复系统，保真度更高。

产品应用

快速克隆；单片段  DNA 组装；DNA 定点突变。

实验步骤

1、实验流程概要

注 1：经双酶切进行线性化的载体无需去磷酸化，经单酶切则需要去磷酸化；

注 2：酶切完成后，应将快速内切酶失活或对目的产物纯化后再用于重组反 应。

注 3 ：载体胶回收时建议长时间电泳与残留的环状质粒区分开后再切胶， 以减少假阳性率。

2. 线性化克隆载体制备

选择合适的克隆位点，对载体进行线性化，载体的线性化可以通过酶切或反向PCR扩增完成。

① 酶切制备

推荐使用 LabFD™快速内切酶进行双酶切 ，使载体线性化完全，以降低转化背景(假阳性克隆)；若使用单酶切进行线性化，可以适当延长酶切时间以减少环状质粒残留。

② 反向  PCR 扩增制备

为减少扩增突变的引入，推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩 增。推荐使用预线性化质粒作为模板 ，以减少环状质粒模板残 留对克隆阳性率的影响。

注  1 ： PCR 产物无非特异性条带时 ，推荐使用 LabFD™  DpnI (  货号 ： F5585S) 1  μl 加入  50  μl PCR 产物中  37℃  1 h ，80℃  20 min  消化 质粒模板即可用于重组反应；反之建议将  PCR 产物胶回收后使用。

3.  插入片段 PCR 引物设计

PCR 引物的 5'  端必须包含与其相邻片段（插入片段或载 体）末端同源的 15~25 nt（推荐 18nt）序列。假如载体为粘 性末端 ，且 3'端突出 ，则引物设计必须包含突出部分；若 5'端 突出 ，则引物设计可以包含突出部分 ，也可以不包含。

插入片段正向扩增引物：

5'—上游载体末端同源序列+酶切位点（可选） + 基因特

异性正向扩增序列—3'    插入片段反向扩增引物：

3'—基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可选）+下游载 体末端同源序列—5'

注 1：尽量选择无重复序列且 GC 含量均匀的区域进行克隆 ，当载体克隆位 点上下游 25 nt 区域内 GC 含量为 40% ~60%时 ，重组效率最高；

注 2 ：包含多个重复序列的片段无法采用无缝克隆的策略进行连接。

注  3 ：包含多个重复序列的片段无法采用无缝克隆的策略进行连接。

4.  插入片段的  PCR 扩增

推荐使用高保真 PCR Mix（ Cat：T1211）进行扩增 ，以减少扩增突变的引入。建议使用纯化后的 PCR 产物进行无缝克   隆反应，若 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物， 可直接使用 ，但加样体积不应超过总反应体积的 20%。

5.  重组反应

① 于冰水浴中配置以下反应体系：

a.最适载体用量(ng) =0.02×载体碱基对数 ，即 0.03 pmol。

b.插入单片段 ，最适片段用量（ ng） = 0.04×片段碱基对数。

c.阴性对照可用来确认线性化载体中是否有环状质粒残留 ，推 荐进行。

注  1 ：若插入单片段长度大于载体 ，则应互换载体与插入片段用量；

注  2 ：若插入片段长度小于 200 bp ，则插入片段应使用 5 倍载体用量；

注  3：若按上述公式计算得到的用量超过最低/最高值，则建议直接按最低/ 最高用量使用；

注  4 ：载体片段过长、插入片段过长或片段数过多 ，克隆菌落数和阳性率 均会降低。

注 5 ：单点突变按照最适载体用量加入体系。

重组反应体系配制完成后 ，用移液枪轻轻吸打混匀各组 分 ，避免产生气泡 ，切勿涡旋。

② 将反应体系置于 50℃ ,  反应 5~15min。

注  1 ：推荐使用  PCR 仪等温控比较精准的仪器进行反应 ，反应时间不足 克隆效率均会降低；

注  2 ： 50℃反应完成后 ，建议进行瞬时离心 ，将反应液收集至管底。

③ 将反应液离心管置于冰上冷却 ，之后进行转化或者储存于-20℃。

注  1 ：-20℃储存的重组产物 ，建议在 1 周内使用。

6.  重组产物转化

取 10μ l 反应液，加入到 100μ l 感受态细胞中，缓慢吸打混匀，冰上放置 30 min。42℃热激 60 s，冰浴 5 min。加 500μl SOC 或 LB 培养基 ，37℃振荡培养 50~60 min（200 rpm）。将菌液均匀涂布在含有对应抗生素的平板上，倒置于 37℃过夜培养。

注 1 ：不同感受态细胞最后的克隆阳性率会有所差别 ，推荐使用转化效 率 >108 CFU/μg 的感受态细胞；

注 2 ：菌落数取决于 PCR 产物与线性化载体的数量和纯度；

7.   阳性克隆检测

挑取单菌落至 10μ l ddH2O 中混匀 ，95℃裂解 10 min   后，取 1μ l 裂解液作为模板，进行菌落 PCR 鉴定(Cat：T0214)， 或将单菌落接种至抗性培养基中培养过夜后，提取质粒进行   酶切鉴定。

注  1 ：菌落  PCR 时建议至少使用一条通用引物 ，避免假阳性结果；

注 2 ：必要时可进一步对阳性结果进行测序鉴定。