储存: 所有试剂均在–20°C保存。 有效期1年
一般说明
葡萄糖脱氢酶（GDH）属于氧化还原酶家族，催化D-葡萄糖+NAD（P）D-葡糖酸（的内酯）+NAD（P）H的反应。来源于动物的酶（EC．1．1．1．47）既能利用NAD，也能利用NADP。本公司的GDH检测是基于四唑盐MTT在NADH偶联的酶促反应中被还原成MTT的还原形式，在565 nm处显示出吸收最大值。在565 nm处的吸光度与酶的活性成正比。检测范围：0.5至200 U/L。
适用性
测定各种生物样品（如血浆、血清、尿液、组织等）中的GDH活性。
试剂盒组成(96孔板供100份检测)
缓 冲 液 | 10 mL | 心肌黄酶 | 120 µL |
NAD/MTT: | 1 mL | 校 准 液 | 1.5 mL |
底 物 | 1 mL | ||
储存: 所有试剂均在–20°C保存。 有效期1年
检测步骤
这种测定是以动力学反应为基础的。为确保相同的孵化时间，向样品中加入反应试剂的速度要快，混合时间要短但要彻底。建议使用多通道移液器。检测可以在任何需要的温度下进行（如25°C或37°C）。
一、样本制备：
血清和血浆直接进行检测。
组织：在解剖前，用磷酸盐缓冲盐水（pH7.4）冲洗组织以去除血液。在含有50mM磷酸二氢钾（pH7.5）的约200µL缓冲液中匀浆组织（50mg）。在4°C下以10,000x g离心15分钟。取上清液进行检测。
细胞裂解液：在4°C下以2,000 x g离心5分钟，收集细胞。对于粘附细胞，不要用蛋白水解酶来收获细胞；而是用刮除器。在含有50mM磷酸二氢钾（pH7.5）的适当体积的冷缓冲液中匀浆或超声处理细胞。在4°C下以10,000 x g离心15分钟。取上清液进行检测。
所有样品可在-20°C至-80°C下储存至少一个月。
二、试剂准备：
将试剂平衡到所需的反应温度（如25℃或37℃）。在使用前对试剂进行简单的离心。
准备足够的反应试剂，每份检测混合如下：8 µL 底物，8 µL NAD/MTT ，1 µL 心肌黄酶 和 70 µL 缓冲液。
三、反 应：
1. 将100µL 水（ODH2O）和100µL 校准液（ODCAL）溶液转移到透明平底96孔板的孔中。
2. 按每个样品20µL的量转移到不同的孔中，然后在每个样品孔中加入80µL反应试剂。短暂敲击孔板以混合。
3. 在酶标仪上读取OD565nm（OD0），并在15分钟后再次读取（OD15）。
四、计 算
从每个样品的OD15中减去OD0来计算DODS值。然后，GDH活性可按以下方式计算：
其中εmtt是还原MTT的摩尔吸收系数。l是光的路径长度，由校准器计算得出。ODCAL和ODH20是校准液和水的OD565nm（ODo）值。t是反应时间（建议时间为30分钟）。反应体积和样品体积分别为100µL和20µL，n是稀释系数。
备注：如果样品GDH活性超过80 U/L，可以使用较短的反应时间，或者将样品在水中稀释并重复检测。对于GDH活性<1 U/L的样品，孵化时间可延长至2小时。
注意事项：本产品仅供研究用，使用过程中应严格遵循实验安全措施。
说明书下载
