说  明

谷氨酸脱氢酶 (GDH) 是一种线粒体酶，催化谷氨酸可逆性氧化脱氨生成 α-酮戊二酸，作为合成代谢和分解代谢途径之间的关键链接。在哺乳动物中，GDH受变构调节，在肝脏、肾脏、大脑和胰腺中具有较高的活性。血清中的GDH 活性可用于区分肝脏炎症所致的肝脏疾病（未显示血清 GDH 活性升高）和导致肝细胞坏死的疾病（导致血清 GDH 升高）。本公司的GDH检测是基于四唑盐MTT在NADH偶联的酶促反应中被还原成MTT的还原形式，在565nm处显示出吸收最大值。在565nm处的吸光度与酶的活性成正比。 检测范围：30分钟反应，0.5至80 U/L；120分钟反应的检测限为0.2 U/L。

应  用

检测各种生物样品（如血浆、血清、尿液、组织和培养基）中的GLDH活性。

试剂盒组成与保存

储存: 所有试剂均在–20°C保存。 有效期6个月

检测步骤

这种测定是以动力学反应为基础的。为确保相同的孵化时间，向样品中加入反应试剂的速度要快，搅拌时间要短但要彻底。建议使用多通道移液器。检测可以在任何需要的温度下进行（如25°C或37°C）。 

 一、样本制备：

血清和血浆直接进行检测。 

组织：在解剖前，用磷酸盐缓冲盐水（pH7.4）冲洗组织以去除血液。在含有50mM磷酸二氢钾（pH7.5）的约200µL缓冲液中匀浆组织（50mg）。在4°C下以10,000 x g离心15分钟。取上清液进行检测。 

细胞裂解液：在4°C下以2,000 x g离心5分钟，收集细胞，对于粘附细胞，不要用蛋白水解酶来收获细胞，而是用刮除器。在含有50mM磷酸二氢钾（pH7.5）的适当体积的冷缓冲液中匀浆或超声处理细胞。在4°C下以10,000 x g离心15分钟。取上清液进行检测。

所有样品可在-20°C至-80°C下储存至少一个月。

二、试剂准备：

将试剂放置到所需的反应温度（如25℃或37℃）。在使用前对试剂进行简单的离心。

反应试剂的制备方法是：为每个96孔试验混合10μL底物、14μL MTT溶液、9μL NAD溶液、1μL 心肌黄酶和50μL缓冲液。

空白反应试剂的制备方法是：为每一个96孔的试验混合14μL MTT溶液，9μLNAD溶液，1μL心肌黄酶和60μL缓冲液（即无底物）。

三、反  应： 

1. 将100μL水（OD_H2O）和100μL 校准液（OD_CAL）转移到透明平底96孔板的孔中。

2. 将20 μL样品转移到2个独立的孔中。在一个样品孔中加入80 μL 反应试剂，在另一个样品孔中加入80 μL空白反应试剂。短暂敲击孔板以混合。

3. 在酶标仪上读取OD_565nm（OD₀），并在30分钟后再次读取（OD₃₀）。

四、计 算

用OD₃₀ 减去每个样品和样品空白孔的OD₀ ，分别计算出ΔOD_S 和ΔOD_B 值。然后，ADH活性可按以下公式计算：

其中ε_mtt是还原MTT的摩尔吸收系数。l是光的路径长度，由校准器计算得出。OD_CAL和OD_H20是校准液和水的OD_565nm（ODo）值。t是反应时间（建议时间为30分钟）。反应体积和样品体积分别为100µL和20µL。n是稀释系数。 

单位定义：单位定义：1个单位（U）的GLDH在pH值为8.2时，每分钟将催化1摩尔谷氨酸转化为酮戊二酸。

备注：如果样品GLDH活性超过80 U/L，可以使用较短的反应时间，或者将样品在水中稀释并重复检测。对于GLDH活性<1 U/L的样品，孵化时间可延长至2小时。

注意事项：本产品仅供研究用，使用过程中应严格遵循实验安全措施。