产品说明
乙醇脱氢酶(ADH) 是一个酶家族，可以催化醇转化为醛的反应，同时将NAD+还原为NADH。人体有9种ADH的同工酶，具有ADH活性的酶类主要存在于肝脏。ADH家族成员是涉及醇去毒作用的主要酶。ADH酶的遗传变异会导致ADH活性的差异和酒精耐受性，可调节酒精中毒易感性。本公司的非放射性比色ADH测定是基于四唑盐MTT在NADH偶联的酶促反应中被还原成MTT的还原形式，并在565nm处显示出吸收最大值。在565nm处的吸光度的增加与酶的活性成正比。线性检测范围（20 μL样品）：0.4至80 U/L。
适用性
适用于各种样品中乙醇脱氢酶的检测，包括组织、细胞和血清。
试剂盒组成(96孔板供100份检测)
缓 冲 液： | 10 mL | 心肌黄酶： 120 µL | |
NAD溶液: | 1 mL | MTT溶液： 1.5 mL | |
底 物： 1 mL 校 准 液： 1.5mL | |||
保存：所有试剂均在–20°C保存。 有效期1年
检测步骤
这种测定是以动力学反应为基础的。为确保相同的孵化时间，向样品中加入工作试剂的速度要快，搅拌时间要短但要彻底。建议使用多通道移液器。检测可以在任何需要的温度下进行（如25°C或37°C）。
一、样本制备：
血清和血浆直接进行检测。
组织：在解剖前，用磷酸盐缓冲盐水（pH7.4）冲洗组织以去除血液。在含有50mM磷酸二氢钾（pH7.5）的约200µL缓冲液中匀浆组织（50mg）。在4°C下以10,000 x g离心15分钟。取上清液进行检测。
细胞裂解液：在4°C下以2,000 x g离心5分钟，收集细胞。对于粘附细胞，不要用蛋白水解酶来收获细胞,而是用刮除器。在含有50mM磷酸二氢钾（pH7.5）的适当体积的冷缓冲液中匀浆或超声处理细胞。在4°C以10,000 x g离心15分钟。取上清液进行检测。
所有样品可在-20°C至-80°C下保存至少一个月。
二、反应试剂准备：
将试剂放置到所需的反应温度（如25℃或37℃）。在使用前对试剂进行简单的离心。
反应试剂（WR）的制备方法是：为每个96孔反应混合5μL底物、14μL MTT溶液、9μL NAD溶液、1μL 心肌黄酶和55μL缓冲液。
空白反应试剂（BWR）的制备方法是：为每一个96孔的试验混合14μL MTT溶液，9μLNAD溶液，1μL心肌黄酶和60μL缓冲液（即无底物）。
三、反 应：
1. 将100μL水（ODH2O）和100μL 校准液（ODCAL）溶液转移到透明平底96孔板的孔中。
2. 将20 μL样品转移到2个独立的孔中。在一个样品孔中加入80 μL WR，在另一个样品孔中加入80 μL BWR。短暂敲击板混合。
3. 在酶标仪上读取OD565nm（OD0），并在30分钟后再次读取（OD30）。
四、计 算
用OD30 减去每个样品和样品空白孔的OD0 ，分别计算出ΔODS 和ΔODB 值。然后，ADH活性可按以下公式计算：
其中εmtt是还原MTT的摩尔吸收系数。l是光的路径长度，由校准器计算得出。ODCAL和ODH20是校准液和水的OD565nm（ODo）值。t是反应时间（建议时间为30分钟）。反应体积和样品体积分别为100µL和20µL。n是稀释系数。
单位定义：在pH值为8.2的条件下，1单位（U）的ADH每分钟将催化1微摩尔的乙醇转化为乙醛。
备注：如果样品ADH活性超过80 U/L，可以使用较短的反应时间，或者将样品在水中稀释并重复检测。对于ADH活性<1 U/L的样品，孵化时间可延长至2小时。
注意事项
本产品仅供研究用，使用过程中应严格遵循实验安全措施。
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