产品货号：S2180

储存条件：2~8℃保存，20%的悬浮液形式

1. 产品简介

Strep-tag 是一种在蛋白纯化系统中应用广泛的亲和标签。它包括两种类型Strep-tagII和TwinStrep-tagII。Strep-tag II是一个短肽标签，由8个氨基酸（WSHPQFEK）组成，可以作为N端或C端标签与蛋白质融合，对重组蛋白的影响很小。进一步改进的Twin Strep-tag II是一个顺序排列的两个Strep-tagII序列（通过内部氨基酸连接），该标签能够像Strep-tagII一样进行温和、快速的纯化。

Strep-tag 标记技术可用于从各种表达系统中纯化功能性链球菌标记蛋白，包括杆状病毒、哺乳动物细胞、酵母和细菌。该技术可耐受不同的缓冲条件和添加剂(高盐、洗涤剂、还原剂、金属离子和螯合剂)，普遍适用于大部分蛋白质性质，而且方便于蛋白质和蛋白质质检相互作用分析。一般来说，上述两种标签都不干扰目标蛋白的折叠或生物活性，不与重金属离子反应，不具有离子交换特性，也不会引起蛋白质聚集。因此，纯化后无需去除Strep-tagII和TwinStrep-tagII。

TMstreptactin Magnetic Beads的配体蛋白是Streptavidin的突变体，其偶联至高度交联的4%琼脂糖微球上。样品中低浓度(50μmol/L)的D-生物素不会影响目的蛋白和TMstreptactin Magnetic Beads的结合效果。该产品在使用后可用平衡液再生，或者使用10mM NaOH进行一定程度的清洗。

2. 技术指标

3. 操作步骤（供参考）

3.1 缓冲液准备

水、缓冲液在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤使用。

平衡/洗杂液：100mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1mM EDTA，pH8.0

或PBS：10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，136mM NaCl，2.6mM KCl，pH7.4

洗脱液：平衡液中加入1-5mM D-生物素

再生液：10mM NaOH

3.2 菌体培养操作步骤如下：

1）挑取含有表达质粒的菌落接种于4ml含有50μg/ml Kana的LB培养基中，37℃振荡培养8h，转速200rpm。

2）取1ml初始培养菌液接种到1L含有50μg/ml Kana的LB培养基中，37℃振荡培养，转速200rpm。

3）检测600nm处吸收值，当OD600=0.5-0.6时，加入100μl诱导剂，16℃振荡培养16h，转速200rpm。

4）5000 rpm（3800×g），离心10min，弃去培养基，保留沉淀。

注：1.细菌表达具有获得表达产物时间短、成本低的优点，但是有些蛋白质不能在大肠杆菌中表达。在这种情况下，酵母、昆虫、哺乳动物或植物细胞可作为替代表达宿主。

3.3 菌体裂解液的准备

1）称取菌体质量，按照菌体：平衡液=1：10（W/V）溶解。

2）冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。

3）取两个10μl破碎后样品，其中一个离心分离沉淀和上清，三个样品中分别加入10μl 2XSDS-PAGE Loading Buffer，电泳鉴定目的蛋白可溶性。

4）如果裂解液特别粘稠，可在每毫升菌体裂解液中加入1-2μl超级核酸酶，室温孵育30min。

5）10,000rpm(15,000×g)，4℃离心20-30 min。

6）将上清转移至干净的容器中。如果重组蛋白表达成包涵体，目的蛋白将在沉淀中。

注：高浓度的游离生物素会影响介质和目的蛋白的结合，可以通过透析、硫酸铵沉淀或者交叉流浓缩/过滤去除

样品在上样前建议离心或用0.22μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率。

3.4 孵育法纯化

1）根据纯化的样品量，取适量TMstreptactin Magnetic Beads加入离心管中，利用磁分离吸附珠子，等上清清澈后吸弃上清；也可加入重力柱中，流干保护液。

2）向离心管中加入5倍介质体积的平衡液清洗介质，利用磁分离吸附珠子等上清清澈后吸弃上清；如使用重力柱，则直接在重力柱中清洗，直接重力流干平衡液；重复两次以上。

3）加入样品，封闭离心管或重力柱管，4℃振荡孵育2-4h或者37℃孵育30min-2h。

4）孵育结束后，利用磁分离吸附珠子等上清清澈后吸弃上清，保留部分上清作为流穿，用于电泳鉴定。

5）用5倍介质体积的洗杂液清洗介质，利用磁分离吸附珠子等上清清澈后吸弃上清（注意不要吸到介质，保留部分上清用于电泳鉴定），重复3-5次，中间建议更换新离心管。

6）加入3-5倍柱体积的洗脱液进行洗脱，室温孵育5min，利用磁分离吸附珠子等上清清澈后吸弃上清或重力柱管收集洗脱液，可重复2-3次。