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常见问题一：没有收集到目标蛋白

在蛋白纯化过程中，使用洗脱液对填料上的目标蛋白进行洗脱，在收集液中没有检测到目标蛋白。

问题自查 1:蛋白表达情况怎么样？ 目标蛋白是否有正常表达？标签是否正常表达且没有被折叠覆盖？

（1）蛋白样品在用填料纯化之前，先跑下 SDS-PAGE 胶并用考马斯亮蓝染色，如果能看到比较清晰且较粗的目标蛋白条带 ，则表达量较高；

（2）蛋白样品跑 WB，用标签抗体检测，如果能检测到目标条带，则标签有正常表达；

（3）检测蛋白样品中的蛋白浓度，并结合 SDS-PAGE 显示的目标蛋白的占比，可以估算出目标蛋白的表达量;

（4）或者也可以考虑在目标蛋白同时加上 GFP 等荧光标记，通过荧光检测得到蛋白表达量；

（5）如果蛋白上清液中没有检测到蛋白 ，且在沉淀中有大量蛋白 ，此时可能是蛋白形成了包涵体

优化方案：如果蛋白表达量不高，需要对前期质粒构建和蛋白表达过程进行优化。例如更换表达载体，更换标签，进行密码子优化，筛选大肠杆菌培养温度和时间，筛选诱导剂（如IPTG）浓度 ，诱导温度和时间等；

问题自查 2： 目标蛋白到哪里去了？ 是没有结合在柱子上 ，还是在柱子上没有洗脱下来？

同时收集上样和洗杂时的流穿液以及洗脱目标蛋白时的洗脱液，如果流穿液中有大量的目标蛋白 ，则表示目标蛋白没有和填料有效结合；如果流穿液和洗脱液中都没有目标蛋白，则表示目标蛋白可能还结合在柱子上 ，没有洗脱下来；

实验优化一：流穿液中有目标蛋白

His 标签

①样品或结合缓冲液条件不合适 ：样品和结合缓冲液中不能含有高浓度的金属螯合剂（例如 EDTA） ，高浓度强还原剂（例如 DTT） ，或者高浓度的咪唑；

②His 标签和填料结合较弱：适当降低上样流速并增加孵育时间；增加 His 标签的数量（6-10 个）；

③调整结合缓冲液的 PH 为 7-8 ， PH 过低会影响蛋白结合；上样量超出填料载量：使用更大体积的层析柱；

GST 标签

① 标签未正确表达： SDS-PAGE 检查目标蛋白分子量是否正确 ，WB 使用抗 GST 抗体确认标签存在。

② 目标蛋白折叠阻碍 GST 标签暴露：在 GST 与目标蛋白间插入柔性连接肽（如15-20个 Gly-Ser 重复序列）。

③蛋白未溶解或形成包涵体：优化表达条件（如降低诱导温度至 16-25℃或降低 IPTG浓度至 0.1-0.5 mM） ；尝试变性溶解（如 6 M 盐酸胍/8 M 尿素）后复性。

④宿主蛋白酶水解目标蛋白或 GST 标签 ：添加蛋白酶抑制剂（如 PMSF、 EDTA 等）

⑤EDTA（>5 mM)、甘油（>10%)可能降低结合效率； β-巯基乙醇会不可逆破坏GSH 树脂，需避免使用；高浓度还原剂 DTT（>5 mM)会破坏结合，需降低浓度至 1-2 mM或改用 TCEP（防止还原型谷胱甘肽氧化）。

⑥pH 或盐浓度不当 ：GST 结合最适 pH 7.0-8.0 ；盐浓度通常 100-300 mM NaCl。

⑦缓冲液中混入游离 GSH（如洗脱液残留）会竞争性抑制结合：透析或置换缓冲液，确保无游离 GSH。

⑧填料长期储存不当（应 4℃保存，避免冻融或干燥）或反复使用后配基脱落：用已知可结合的 GST 标准蛋白测试填料活性。

⑨上样流速过快 ：建议保留时间 3-5 min ，孵育 10-30 min 可提高结合率。

⑩洗脱液浓度不够 ，可尝试使用含 10-40 mM 还原型 GSH 的洗脱液 ，拉梯度分段收集洗脱样品。

⑪GST 本身可形成二聚体 ， 若目标蛋白也形成聚集体 ， 可能影响结合： 非还原SDS-PAGE 或 SEC 检查聚集状态。

‌⑫填料批次差异 ：更换填料。

MBP 标签

①标签未正确表达：SDS-PAGE 检查目标蛋白分子量是否正确，WB 使用抗 MBP 抗体确认标签存在。

②目标蛋白折叠阻碍 MBP 标签暴露 ：在 MBP 与目标蛋白间插入柔性连接肽（如15-20 个 Gly-Ser 重复序列）。

③蛋白未溶解或形成包涵体：优化表达条件（如降低诱导温度至 16-25℃或降低 IPTG浓度至 0.1-0.5 mM） ；尝试变性溶解（如 6 M 盐酸胍/8 M 尿素）后复性。

④ 宿主蛋白酶水解目标蛋白或 MBP 标签：添加蛋白酶抑制剂（如 PMSF、EDTA 等）。

⑤高浓度咪唑（>20 mM)、 EDTA（>1 mM)、甘油（>10%)可能竞争性抑制结合：推荐缓冲液 20 mM Tris-HCl +200 mM NaCl pH 7.4-8.0 +1 mM EDTA（可选）。

⑥pH 或盐浓度不当 ：MBP 结合最适 pH 7.0-8.0；盐浓度通常 150-300 mM NaCl。

⑦缓冲液中混入麦芽糖（如培养基残留）会竞争性结合 MBP：透析或置换缓冲液，确保无游离麦芽糖。

⑧填料长期储存不当（应 4℃保存，避免冻融或干燥）或反复使用后配基脱落：用已知可结合的 MBP 标准蛋白测试填料活性。

⑨上样流速过快 ：建议保留时间 3-5 min。

⑩柱子平衡前没有做好清洗会影响平衡效果和蛋白结合 ，新柱子第一次使用建议做C IP 清洗。

⑪填料批次差异 ：更换填料。 "

实验优化二： 目标蛋白没有洗脱下来： 

His 标签

①洗脱条件过于温和 ：适当增加洗脱缓冲液中的咪唑浓度 ，或者尝试降低洗脱液的 PH；增加洗脱步骤和时间；

②目标蛋白与填料发生非特异性结合 ：在洗脱缓冲液中加入非离子型去垢剂（例如2% Triton X-100） ，或者增加洗脱液中 NaCl 的浓度

③目标蛋白在填料上发生了沉淀 ：减少上样量 ，添加去垢剂或者在变性条件下进行洗脱；

GST 标签

①增加洗脱缓冲液的用量 ，增长洗脱时间；

②适当提高洗脱缓冲液中还原型谷胱甘肽的浓度（20-40 mM）；

③洗脱缓冲液 PH 过低 ：提高 PH 至 8-9 可促进洗脱；

④提高洗脱液中的离子强度（适当增加 0.1-0.2 M NaCl）；

⑤适当加入 DTT（1-10 mM）抑制还原型谷胱甘肽被氧化；

⑥目标蛋白和填料间发生非特异相互作用：在洗脱缓冲液中加入非离子型去垢剂（例如 0.1% Triton X-100）

MBP 标签

①提高麦芽糖浓度 ：将洗脱液中的麦芽糖从标准 10 mM 增至  20-50 mM ，最高可尝试500 mM

②增加盐浓度 ：在洗脱缓冲液中加入 0.5-1 M NaCl ，破坏非特异性相互作用孵育 ，而非柱层析 ，提高洗脱效率

③4°C 过夜孵育 ：降低流速或延长洗脱时间 ，让蛋白充分解离（注意蛋白稳定性）

常见问题二：蛋白纯度不高 ，杂带较多

问题描述：收集液中有目标蛋白，但同时也有很多杂蛋白。这种情况一般发生在使用His 标签时， 以下主要对 His 标签蛋白纯化进行讲解。

问题自查 1 是否目标蛋白本身表达不高 ，而杂蛋白表达较高

实验优化 1：按照问题 1 中的方法检测目标蛋白表达；优化质粒构建和蛋白表达的步骤；

问题自查 2 蛋白是否容易降解？

在 SDS-PAGE 胶上观察杂带的分子量；如果杂带的分子量比目标蛋白分子量小，且相差值约为几个结构域或特定酶切位点，说明可能该杂带是由目标蛋白降解产生的。

优化方案：

（1）使用线性洗脱的方式： 500 mM 咪唑 ，0%-100%线性梯度洗脱 10 CV；

（2）漂洗缓冲液中加入少量咪唑；

（3）裂解液和缓冲液中添加去垢剂（2% Triton X-100/Tween 20）；或添加甘油（20%以内） ；增加缓冲液中 NaCl 浓度至 500 mM

（4）其他考虑方向包括 His 标签蛋白被部分降解 ，优化结合和洗脱条件 ，尝试不同金属离子螯合的填料，构建双标签蛋白，添加去垢剂，还原剂等添加剂破坏杂质和目的蛋白间的相互作用等等

（5）在镍柱纯化之后增加离子交换和分子筛等步骤继续纯化；

常见问题三：填料变色

（1）镍柱变白 ：如果上样量较大 ，镍柱填料可能由于结合了大量的蛋白而呈现发白的现象 ，这是正常的；

但如果缓冲液中存在螯合剂如  EDTA 等 ，可能导致镍离子从柱上脱落而发白 ，并且导致目的蛋白的结合量降低；

（2）镍柱出现棕色 ：这主要是缓冲液中还原剂的影响。在常规的填料中存在的游离镍离子 ，可能会被  DTT 还原生成棕色的沉淀。

（3）杂质与目的蛋白有相互作用 ：加入去垢剂、还原剂、甘油等破坏杂蛋白与目的蛋白之间的相互作用 ，或者尝试调整缓冲液的盐浓度。

常见问题四：柱子堵了

问题描述：柱子发生堵塞，流速降低，压力增高；此时需要根据说明书对层析柱进行清洗。

问题自查 1 样品和缓冲液上样前有没有过滤？

实验优化 1 ：收集到蛋白样品之后，建议先用超声破碎，然后离心取上清，然后使用0.45um 或者 0.2um 的滤膜进行过滤；

问题自查 2 是否样品浓度或者粘性过高？

实验优化 2 ：可以适当稀释样品；如果样品粘性比较高，也可能是样品中含有高浓度的宿主核酸，可以增加超声时间，或者加入核酸酶（5 ug/ml DNase1, 1 mM Mg2+）进行处理。

问题自查 3 层析柱有没有定期清洗？

实验优化 3 ：层析柱在使用 5-10 次之后，建议对层析柱进行清洗。清洗方法可以参考说明

常见问题五:填料应该如何清洁再生？

His 标签

常规清洗：可使用 5-10 倍柱体积的纯水或者漂洗缓冲溶液对柱子进行清洗。

当填料在使用过程中发现反压过高或者填料上出现明显污染，需要进行在位清洗（CIP）操作。

N30210/N30230 填料在位清洗前需先去除镍离子，（不脱镍直接上碱洗可能会产生棕色沉淀导致柱子堵塞） ；为了避免不同样品间的相互干扰，或者当介质污染比较严重时(反压增加) ，需要对介质进行在位清洗。在位清洗前，需要预先除去介质上螯合的金属离子(见再生操作) 。在位清洗时，可采用反向冲洗的方法。

1)对于以离子键结合的蛋白，可用 2~3CV 以上的 2M NaCl 清洗，

2)对沉淀蛋白、以疏水性结合的蛋白或脂蛋白，可用 1MNaOH 清洗(1~2h)，并用 3~10CV平衡液和 3 CV  以上的纯水冲洗。

3)对疏水性结合的蛋白、脂蛋白和脂类物质，可用 5~10CV 的 70%乙醇或 30%异丙醇清洗(20min 以上) ，并用 3~10CV 的纯水冲洗。

此外，也可用2CV 含去污剂的碱性或酸性溶液清洗。如用 0.1~0.5%的非离子去污剂+0. 1M乙酸冲洗 1~2h ，并用 5~10CV 的 70%乙醇冲洗去除去污剂，然后用 3~10CV 的纯水冲洗。

N30250 填料可直接进行在位清洗

当填料在使用过程中发现反压过高或者填料上出现明显污染，需要进行在位清洗操作。

1)  去除强疏水性结合的蛋白、脂蛋白和脂类

方法一:使用 30%异丙醇清洗 5~10CV ，接触时间为 15~20min 可以去除此类污染物，再用 10CV 的纯水清洗;

方法二:使用 0.3M 或 0.5M NaOH 溶液冲洗填料 3CV ，然后用 10-15CV 的纯水清洗。

2)去除离子作用结合的蛋白

使用 1.5M NaCI 溶液清洗 10~ 15min ，再用 10CV 纯水清洗，清洗好

的柱子用 2CV 的 20%乙醇冲洗，置于 2~8°C 保存。

GST 标签

GST 标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生，但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量性能下降,  这时需要对填料进行清洗。

去除一些沉淀或变性物质：用 2 倍柱体积的 6 M 盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用 5倍柱体积的 PBS, pH 7.4 清洗。

去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质：用 3-4 倍柱体积的 70%乙醇或 2 倍柱体积的 1% Triton X-100 清洗，然后立即用 5 倍柱体积的 PBS, pH 7.4 清洗。

MBP 标签

随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量都下降，这时可按照下面方法对填料进行清洗。 

1）3 倍柱体积的去离子水;

2）3 倍柱体积的 0.1% SDS 或 0.1 M NaOH 溶液;

3）3 倍柱体积去离子水，20%乙醇 2-8℃保存。

Strep 标签

继续纯化同一目的蛋白时：用 5-15 CV 的含平衡液洗柱，柱子可重新使用。

当纯化不同蛋白或突变体时：用 3 CV 的去离子水清洗，用 5-15CV- 10-50 mM NaOH 再生，然后用 3 CV  的去离子水清洗

常见问题六：摇菌 250ml ，用填料纯化最少需要几毫升？

常规来说 250ml 菌液可以摇出 1g 左右菌泥，重悬破碎体积为 10ml 左右，大约用 0.5-1ml左右的填料就够了，填料载量是 XX mg/ml 左右。

也和客户的蛋白表达量有很大关系，如果客户的蛋白表达量明显偏低或偏高的话，填料量是需要对应减少或增加的。客户可以破碎后先跑个电泳看下大致表达情况。

常见问题七：标签蛋白纯化试剂盒的缓冲液组分是什么？

H1032/H1035 试剂盒配方

裂解液：ripa 中

结合缓冲液：ripa 中（50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate， 0.1% SDS 等）

漂洗缓冲液：20mM 咪唑，0.3M NaCl ，50mM Tris    pH7.9

洗脱缓冲液：500mM 咪唑，0.5M NaCl ，50mM Tris    pH7.9

P1051  试剂盒配方

裂解：10mM PBS (一袋的量)+1%Triton X- 100 (10mL)

漂洗：10mM PBS(一袋的量)

洗脱：10mM PBS(一袋的量）+10-15mM reduced glutathione (3.07323g)

M1051 试剂盒配方

裂解：20 mM Tris pH7.4 ，200 mM NaCl ，1 mM EDTA  根据需求加 DTT PMSF

漂洗：50mM Tris-HCl PH:8.0(50mL) ，500mM NaCl（29.22g）

洗脱：50mM Tris-HCl PH:8.0(50mL) ，500mM NaCl（29.22g），额外加 20mM 麦芽糖

常见问题八：标签该如何选择？

标签的选择主要是根据蛋白的特点以及对纯度的要求，新手建议可以从 His 标签开始做起。

①His 标签标签小，纯化步骤简便，纯化条件温和，能纯化可溶性/包涵体蛋白，一般不会影响蛋白的功能结构，且可以产出大量的目标蛋白，纯度和其他标签相比略低，如果对纯度不是要求特别高的情况下首选；

②GST 标签洗脱条件温和，有助于保持蛋白功能活性，适合 pull-down  检测，具有很好的线性动态范围，但分子量较大，需要在纯化后去除标签，且不适宜变性环境；

③MBP 标签可以减少目标蛋白的降解，增加蛋白的表达量和稳定性，提高表达产物的水溶性，但标签较大，对蛋白的结构和功能可能会有一定影响；

④Strep 标签能纯化出高纯度的目标蛋白，纯化条件温和，能进行变性条件下的纯化。纯化柱和填料的价格和其他标签相比略高；