产品货号：c1059

储存条件：-20℃避光保存

1.产品简介

菁染料是性能优良的荧光标记染料，摩尔吸光系数在荧光染料中是最高的，其琥珀酰亚胺酯是最常用的脂肪氨基标记试剂，广泛用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测。通过改变次甲基链的长度，可改变其荧光发射波长，每增加一个双键，按照 Huoffman规则正好红移约100nm。菁染料Cy3和Cy5已成为基因芯片的首选荧光标记物；另外，Cy5，Cy5.5和Cy7的吸收在近红外区背景非常低，是荧光强度最高、最稳定的长波长染料。特别适合于活体小动物体内成像代替放射性元素。但由于菁染料，尤其是不对称菁染料的合成副反应多，副产物极性相近，产物的分离提纯相当困难。菁染料特别是水溶性菁染料分子极性大，分离提纯越加困难。

表 1. 菁染料琥珀酰亚胺酯的性质参数

2.操作步骤

2.1水溶性Cy3 NHS标记anti-GST多克隆抗体

市场上买到的抗体如果含有其它蛋白(例如serumal bumin或gelatin等)或带氨基的缓冲液会影响标记，在标记前需纯化。

1.在1L 0.15M NaCI溶液中透析anti-GST抗体(浓度为0.5mL at 3mg/mL)，常温透析4小时。

2.在4°C用新鲜的1L 0.15M NaCI溶液再透析过夜。

3.第二天用1L 0.1M NaHCO3(pH8.3)透析4小时。

4.用0.22 μm注射器过滤头过滤抗体溶液。

5.用0.1M NaHCO3稀释少量的抗体，在280nm处测其紫外吸收值计算标记抗体的总量(IgG antibody摩尔吸光系数170000M^-1cm^-1at 280nm).

6.用DMSO配置Cy3 NHS(MW765.95)溶液浓度为10mg/mL；计算所需体积以得到想要的CyDye NHS和抗体的比值(例如20:1)，然后慢慢将其入到抗体溶液中，同时在暗处常温缓慢搅拌45分钟。

7.用1L 0.15M NaCI溶液常温避光透析4小时除去未标记上的Cy3。

8.在4°C用新鲜的1L 0.15M NaCI溶液再避光透析过夜。

9.用1L of 0.01M PBS/ 0.01%叠氮化钠溶液常温避光透析4小时，在4°C常温避光再次透析过夜。

10.用0.22um注射器过滤头过滤抗体溶液。 

11.用0.01M PBS/0.01%叠氮化钠整数倍稀释标记抗体溶液，测量280nm(蛋白)和552nm(Cy)处的紫外可见吸光度。

12.产品冷冻干燥成粉末或在 0.01MPBS/0.01%叠氮化钠溶液中，-20°C避光储存。

2.2水溶性Cy5 NHS标记(D-ser2)-leucineenkephalin

1.Cy5 NHS 1.0mg溶解于400μL DMSO后，加入到1mL的玻璃瓶中盛有(D-ser2)-leucineenkephalin acetate(YSGFLT，0.75mg)的400μL DMSO溶液。(Dye和peptide投料比是1:1)

2.然后加入15uL三乙胺，常温避光搅拌反应混合物过夜。

3.用HPLC纯化蛋白，使用蛋白C18柱子(25 cm×10 mm)，每次上样注入2x400uL，30分钟梯度洗脱从0.1%TFA水溶液到MeCN：H2O(0.1%TFA)=70：30，流速4mL/min。(对不同的蛋白选择不同的合适HPLC梯度流动相)

4.收集适当的色带峰，标记多肽的保留时间比未标记的多肽长。

5.产品冷冻干燥成粉末或在水溶液中，-20°C避光储存；必要时可用质谱表征。

6.CyDye标记的蛋白稳定性取决于蛋白本身。例如标记的IgG在4°C可避光保存2月；更长期的保存需加入等体积的甘油-20°C避光保存。

2.3水溶性CyDyeSE标记 OLIGO

    氨基封端的 OLIGO可以标记CyDye SE，但是非常困难；标记前因为OILGO经氨水脱保护，请务必洗涤掉所有的残余氨水。然后将样品真空干燥；然后溶于0.25ml的0.5M NaCI溶液中，用Sephadex G-50脱盐，用5.0mM borate缓冲液平衡到pH=8.0，然后用以上硼酸缓冲液冲下OLIGO。然后浓缩至干的样品溶于0.1M carbonate buffer(pH8.5-9.0)；在0.5mL碳酸缓冲液中30nmoles的OLIGO加入到CyDye SE的玻璃瓶中室温避光，密闭搅拌反应60min。反应物经SephadexG-50或RP-HPLC过柱纯化，冷冻干燥后避光保存。

注意：Oligonucleotides和oligopeptides由于太小会留在过滤膜上或在冻存管内贴壁成膜，无法标记。

2.4活体成像领域

SPF级BALB/C裸鼠，6-8周龄，18-20克，实验前24h自由进食、饮水。

于实验裸鼠腹腔内注射 2%戊巴比妥钠300μL(215mg/kg)麻醉动物。将裸鼠俯卧位平放于小动物多光谱活体成像系统的记录暗箱中。实验时将Cy7或Cy7标记的生物分子或药物DMSO稀释后，于裸鼠尾静脉注射200μL(0.5mg/g)(最佳用量和时间需要客户根据自己的仪器和药物试剂等条件优化)，每5min记录1张动物在体内发射荧光的成像图片，分析荧光药物的分布情况。对照鼠不注射药物，进行同时记录。记录结束后迅速解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、肾 等脏器，进行成像。

Cy7检测时激发波长700〜770nm带通，发射波长790nm长通。液晶可调谐滤光片扫描范围780〜950nm，扫描步进10nm。曝光时间为500ms。

不同的药物代谢时间不一样，注射入裸鼠体内，荧光立即分布全身，然后逐歩向膀胱聚集，呈现显著的肾 排泄的特点一般 4~6小时，快得只有30分钟；如果是骨骼等部位靶寻的Cy7标记药物，有客户反映一周后活体成像系统仍能检测到荧光成像。

器官切片观察：将解剖的器官迅速放置于4%多聚甲醛固定4小时以上，0%，20%，30%PBS蔗糖依次沉底，20μm切片，多聚赖氨酸洗过的载玻片贴片，晾干，DAPI染色。共聚焦显微镜观察，激光器为氦氖633nm。

CyDye NHS水溶液现配现用不能储存。任何溶解后的CyDye NHS粉末最好立即使用；无水的DMSO溶液-20°C保存最多2个星期。

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