货号：T5204S
存储条件：-20℃，2年有效
产品说明
T4 RNA Ligase 1是一种来源于 T4 噬菌体的 ATP 依赖性连接酶,主要催化单链 RNA 或单链 DNA分子间或分子内5'-磷酸基团与 3'-羟基之间形成磷酸二酯键，该过程伴随着 ATP 水解为 AMP 和 PPi。T4 RNA Ligase1对不同底物连接效率有显著区别:SSRNA-SSRNA>SSRNA-SSDNA>SSDNA-SSDNA。此外，T4RNALigase1也可用于 RNA和单核苷酸之间的连接，单核苷酸必须为5'和3'均磷酸化的形式，常用于 RNA 的 3'末端标记。
产品组分
组分 | 1000U | 5000U |
T4 RNA Ligase 1 (10 U/μl） | 100 μl | 500 μl |
10× T4 Rnl1 Buffer | 1.5 ml | 1.5 ml |
50% PEG 8000 (RNase-free) | 1 ml | 2×1 ml |
ATP (10 mM） | 200 μl | 1 ml |
酶活定义
一个单位定义为在37℃下，30 min内将1 nmol荧光标记的 rA16转化为具有磷酸酶抗性的形式所需的酶量
应用
1. RNA 环化、RNA 文库构建;
2. 标记具有 5'-[²P] pCp 的 RNA 3' 末端;
3. 在蛋白中掺入非天然氨基酸;
4. 单链 Oligo RNA 及 Oligo DNA 合成。
质量控制
蛋白纯度
经 SDS-PAGE 凝胶电泳检测，蛋白纯度不低于95%。
非特异性内切酶活性
37°C下，在20μ反应体系中将10UT4 RNA Ligase1与200ng 超螺旋质粒 DNA 共同温育4 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，少于20% 的
质粒 DNA转变成缺刻或线性状态。
DNase 活性
37℃下，在20 μ反应体系中将10 UT4 RNA Ligase1与 15ng 双链 DNA片段共同温育16 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，双链DNA 片段无变化。
RNase 活性
37°C下，在10μ反应体系中将10 UT4 RNA Ligase1与500ng RNA 共同温育1h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，超过 90% 的RNA保持完整。
使用方法
1. ssRNA环化连接反应
① 于冰上配制如下反应体系：
试剂 | 使用量 |
ssRNAa | 10 pmol |
10× T4 Rnl1 Buffer | 2 μl |
T4 RNA Ligase 1 (10 U/μl) | 1 μl |
ATP (稀释至1 mM)b | 1 μl |
RNase Inhibitor, Murine (40 U/μl) (可选) | 0.5 μl |
Nuclease-Free Water | To 20 μl |
a. 在样品比较少的情况下，可以大幅减少 ssRNA 的用量；
b. 产品附带的 ATP 用于环化反应时浓度过高，需要稀释后使用。
② 37℃孵育30 min。在连接效果不佳时可尝试25℃孵育1~2 h或 16℃过夜以获得最佳连接效果。
③ 65℃孵育15 min终止反应。
2. 单链 RNA 或 DNA 的分子间连接反应
① 于冰上配制如下反应体系：
试剂 | 使用量 |
ssRNA or ssDNAc | 10 pmol |
10× T4 Rnl1 Buffer | 2 μl |
T4 RNA Ligase 1 (10 U/μl) | 1 μl |
50% PEG 8000d | 6~10ul |
ATP (稀释至1 mM)b | 1 μl |
RNase Inhibitor, Murine (40 U/μl) (可选) | 0.5 μl |
Nuclease-Free Water | To 20 μl |
c. 用于分子之间的连接，通常提供 5'磷酸的核酸 3'羟基需要被封闭(例如氨基修饰)，提供 3'羟基的核酸 5'端需要被封闭(例如5'端为羟基)。
d. 如果提供3'羟基的核酸的量有所不足，提供 5'磷酸的核酸的用量可以是提供 3'羟基的核酸的 2倍左右;
e. PEG8000 的终浓度可以在 15%~25% 范围内根据连接效果适当调节。
②37°C孵育 30 min。在连接效果不佳时可尝试 25°C孵育1~2 h或16°C过夜以获得最佳连接效果。
③ 65°C孵育 15 min 终止反应。
3. RNA 3' 末端标记
① 于冰上配制如下反应体系：
试剂 | 使用量 |
ssRNA | 1ug |
10× T4 Rnl1 Buffer | 3 μl |
T4 RNA Ligase 1 (10 U/μl) | 1 μl |
ATP (10mM)b | 3 μl |
[32P] pCp | 终浓度1uM |
DMSO | 终浓度10% |
Nuclease-Free Water | To 30 μl |
② 16℃过夜； ③ 65 ℃孵育15 min终止反应。
注意事项
1. 无论底物是单链 RNA 还是单链 DNA，需确保 5'末端磷酸化或腺苷酰化，3'末端是羟基；
2. 该酶无法连接双链DNA或RNA；
3. 涉及RNA的操作需严格避免RNase污染，可在反应体系中加入适量RNase Inhibitor (REF：R2000)防止RNA降解；
4. 用于RNA 3'末端标记时需在反应体系中添加终浓度10%的DMSO。
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