产品货号：E4001

储存条件：-20℃保存，冰袋运输。Biotin-11-dUTP 请于 4℃避光保存

产品组分

1. 产品简介

DNA 探针生物素末端标记试剂盒是一款对 DNA 探针进行高效末端标记的试剂盒。试剂盒采用基因工程改造优化的TdT，可以在 DNA 片段 3' 末端标记多个生物素集团，与普通生物素标记试剂盒相比，可以大幅提升后续生物素检测反应的灵敏度。由于生物素标记于 DNA 片段的末端，不会影响该 DNA 片段与特定蛋白质或互补核酸序列的结合，因而可广泛应用于 EMSA 检测、Northern 杂交、Southern 杂交、斑点杂交和原位杂交等实验研究。

2. 实验步骤：

2.1准备工作：

取出 5×TdT buffer、Biotin-11-dUTP 和 ddH2O，解冻后置于冰上备用。

准备待标记探针：

a. 单链 DNA：直接用水稀释至 1μM，置于冰上备用。

b. 双链 DNA：95℃加热 2min，迅速置于冰水浴变性为单链，再用水稀释至 1μM，置于冰上备用。

注：1μM DNA 双链质量浓度换算公式：质量浓度（ng/ul）=碱基对数×0.66。例：300bp 的 DNA 双链，摩尔浓度为 1μM，则对应的质量浓度为 300×0.66=198ng/ul。 

下表为常见 bp 长度的摩尔浓度与质量浓度换算表：

2.2 DNA 探针标记

根据下表配制 50ul 反应体系:

用移液器轻轻吹打混匀，切勿涡旋振荡。37℃孵育 30min。

反应结束加入 2.5ul 探针标记终止液，轻轻混匀，终止反应。

2.3 TdT 的去除(EMSA 须此步，分子杂交不须)

探针标记反应终止后，加入 52.5 µl 氯仿-异戊醇(24:1)，涡旋振荡使有机相和水相充分混合，静置等待有机相和水相分层。

13,000g 离心 1-2 分钟，吸取上清备用。上清即为被生物素标记的单链 DNA 探针。

2.4 生物素标记检测（可选）

取带正电荷尼龙膜裁剪成合适大小，做好标记。用灭菌双蒸水浸泡 10min，再用 2×SSC 缓冲液浸泡 30min，室温晾干。

取 2μl 待测探针滴加至尼龙膜毛面，确保液滴完全吸收，在膜上形成一个圆形小斑点。

将尼龙膜放在干净的滤纸上，室温干燥 30min，再将尼龙膜放在烘箱中，120℃烘烤 30min。

使用生物素检测试剂盒（货号 EM001）检测生物素信号，检测前用 TBST 洗膜 5min。 

2.5 生物素标记 EMSA 探针的制备

对于步骤2.3标记好的单链 DNA 探针，把正义链和反义链等体积混合。若待标记探针为双链 DNA 探针，标记后直接进入下一步。

加入 10×退火缓冲液，使终浓度为 1×（例：100μl 探针液加 11μl 缓冲液），混匀。

退火条件：金属浴或水浴 95℃变性 2min 后，取出静置 30min 左右，直至自然冷却至室温。

退火反应结束后，-20ºC 保存标记好的 EMSA 探针。此时的 EMSA 探针已经可以直接用于后续的 EMSA 检测，也可以对探针进行适当纯化后再进行 EMSA 检测。

注意事项：

1、本试剂盒可用于 DNA 单链探针或 DNA 双链探针的 3'末端生物素标记。推荐使用 PCR 合成的 DNA 双链作为待标记探针，避免互补链量不一致导致多余单链的形成。

2、如果使用双链 DNA 作为待标记探针，使用前需 95℃加热 2min，迅速置于冰水浴变性后再进行末端标记。标记结束后需要进行退火以形成完整的双链探针。

3、标记探针一般不需要进一步纯化，确需纯化的，建议采用乙醇沉淀法。标记探针暂不使用的，请保存于-20ºC，使用时在冰上解冻。

4、实验需自备氯仿、异戊醇、带正电荷尼龙膜及生物素检测相关试剂（推荐EMSA检测试剂盒，货号EM001）。

5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。