货号：T5208

储存条件：-20℃

产品组成

注：Buffer融化时，出现少量沉淀属正常现象，请待溶液恢复至室温，震荡混匀后使用。

注：1U=1 Weiss unit

产品简介

T4 DNA Ligase ultra是T4 DNA Ligase的耐热突变体，催化双链DNA或RNA之间的5'-磷酸基团和3'-羟基之间形成磷酸二酯键，与T4 DNA Ligase相比大幅度提高了热稳定性，最高可耐受至50℃，从而提高了它在Golden Gate Assembly中的连接效率。T4 DNA Ligase ultra不仅能够连接平末端和粘性末端，还可以修补双链DNA和一些DNA/RNA杂交链中的单链切刻。与T4 DNA Ligase一致，T4 DNA Ligase ultra也需要ATP作为辅助因子。

酶活单位定义

37℃条件下，1 Weiss unit的酶在20min内催化1nmol的[PPi]转变为活性炭吸附态。1 Weiss unit等同于约200个粘性末端连接反应单位（CEU），相当于在16℃条件下，30min内连接50% HindIII消化后的λDNA片段。

失活条件

65℃，10 min。

产品应用

1.酶切克隆；

2. NGS测序；

3. dsDNA或DNA/RNA杂合体中的单链缺口修复。

质量控制

蛋白纯度

经SDS-PAGE凝胶电泳检测，蛋白纯度不低于95%。

非特异性内切酶活性

37℃下，在20 μl反应体系中将5 U T4 DNA Ligase ultra与200 ng超螺旋质粒DNA共同温育4 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，少于20%的质粒DNA转变成缺刻或线性状态。

DNase活性

37℃下，在20 μl反应体系中将5 U T4 DNA Ligase ultra与15 ng双链DNA片段共同温育16 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，双链DNA片段无变化。

RNase 活性

37℃下，在10 μl反应体系中将5 U T4 DNA Ligase ultra与500 ng RNA共同温育1 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，超过90%的RNA保持完整。

蓝白斑测试

22℃条件下，使用5 U T4 DNA Ligase ultra连接pUC19 DNA/HindIII，pUC19 DNA/PstI，pUC19 DNA/SmaI消化产物1 h，然后用Mach1-T1 E. coli感受态细胞转化连接产物，检测到少于1%的白斑。

宿主DNA残留

采用中国药典2025版四部通则3407外源性DNA残留量测定法第三法定量PCR法，本品中大肠杆菌宿主细胞DNA残留量不超过1拷贝/5 U。

使用方法

1. DNA插入片段连接至载体DNA（粘性末端连接）

1) 于冰上配制如下反应体系：

2) 充分混匀并瞬离，22℃温育10min；

3) 取1~5ul的连接产物用于50ul化学感受态细胞的转化，或者取1~2ul用于50ul电转感受态细胞的转化。

注：如果连接反应产物用于电转化，应使用离心柱或者氯仿抽提清洁DNA代替热失活步骤。

2. DNA插入片段连接至载体DNA（平末端连接）

1) 于冰上配制如下反应体系：

2) 充分混匀并瞬离，22℃温育1h；

3) 取1~5ul的连接产物用于50ul化学感受态细胞的转化，或者取1~2ul用于50ul电转感受态细胞的转化。

注：如果连接反应产物用于电转化，应使用离心柱或者氯仿抽提清洁DNA代替热失活步骤。

注意事项

1. 虽然本产品可耐受高温至50℃，但不推荐在高温进行常规的酶切连接反应，会由于DNA末端无法充分互补配对导致连接效率大幅度下降。

2. 连接反应液添加量不应该超过感受态细胞体积的10%，不推荐体系中加入过量的T4 DNA Ligase ultra；

3. 与 T4 DNA Ligase ultra 结合的DNA可能会在琼脂糖凝胶中出现带移或弥散，为了避免此现象，可以在上样前对酶进行热失活，必要时加入适量的SDS；

4. 聚乙二醇(PEG)能极大地提高平末端连接的连接效率，PEG 8000的推荐添加量是连接体系的5% (w/v)；

5. 电转化效率可能通过对T4 DNA Ligase ultra热失活或者使用离心柱或者氯仿抽提纯化DNA方式来提高；

6. 转化子数目可通过延长反应时间至1 h而增加。