货号：S1181

存储条件：2-8℃保存，不可冷冻。缓冲液有效期1年，纯化beads有效期3年

产品简介：

本试剂盒适用于携带 Strep-tag II与 Twin-Strep-tag 标签重组蛋白的亲和纯化。

Strep-tag II 氨基酸序列：WSHPQFEK

Twin-Strep-tag 氨基酸序列：WSHPQFEK-GGGSGGGSGG-SA-WSHPQFEK

试剂盒预装全套实验试剂：裂解液、结合液、预添加生物素的洗脱液、Streptactin agarose 4FF 亲和填料、重力层析空柱、溶菌酶，可一站式完成原核表达 Strep 标签蛋白快速纯化，操作简便，适合重力柱常压纯化。

原理：Streptactin 与 Strep-tag II 特异性亲和；游离生物素竞争性结合配体，实现目标蛋白温和洗脱。

产品组成：

操作步骤（仅供参考）：

步骤 1：菌体裂解（大肠杆菌样品）

1. 收集诱导表达完成的大肠杆菌菌液，4℃，8000 g 离心 10 min，弃上清，收集湿菌体；

按照 1 g 湿菌 : 5–10 mL 裂解液的比例，用试剂盒内 【裂解液】重悬菌体；

2. 每10 mL菌体重悬液加入1 mg溶菌酶（试剂盒0663组分），充分混匀；

可选：用前加入终浓度1 mM PMSF（PMSF水溶液不稳定，务必现加）；

3. 冰上孵育 30–60 min，期间每隔 10 min 颠倒混匀一次；

注：若蛋白难裂解：可搭配超声破碎（冰浴超声，防止蛋白高温变性） 

4. 裂解完成后，4℃、12000 g离心20–30 min；小心吸取上层澄清上清，弃沉淀（包涵体 / 细胞碎片）；

注：不要吸到沉淀，碎片会堵塞柱子、降低纯化效果！上清尽量用0.22 μm滤膜过滤。

步骤 2：层析柱与填料预处理

1. 取出 AC003 重力空柱，用蒸馏水或乙醇溶液泡好垫片后，将下垫片装入空柱底部。添加下堵头后在空管中加入结合缓冲液润洗空柱，打开下端堵头，流出保存液；

充分颠倒混匀 S1180 Streptactin agarose 4FF 填料，吸取2-3 mL 填料悬液装入重力柱；

2. 让柱内储存液自然流干（液面刚好抵达填料上层表面，不可把填料抽干干裂！ 干裂会导致填料失效）；

3. 加入 5 倍柱体积【结合液（S1181-C）】平衡柱子，液体自然流尽，完成平衡。

注：填料上方液体不能流干！否则会导致填料失效

步骤 3：样品上样结合

1. 将步骤 1 制备好的澄清菌体上清缓慢加入平衡好的层析柱；

2. 盖上柱上下盖，可选择两种方式：

方案 A（静态结合，推荐新手，结合效率更高）：4℃翻转摇床孵育 30–60 min，随后装回重力柱，打开下端流出液体；

方案 B（重力连续流）：控制流速，依靠重力缓慢过柱，整体上样时间不少于 30 min；

3. 收集流穿液（上样后流出的液体），保留，后续 WB 检测判断蛋白是否结合充分。

步骤 4：洗涤去除杂蛋白

1. 上样结束后，加入 5–8 倍柱体积【结合液 S1181-C】 洗涤填料；

2. 分 2–3 次洗涤，每次等待液体自然流干；

3. 收集洗涤组分，可留存用于后续电泳检测杂蛋白去除效果。

注：若杂蛋白较多可适当增加洗涤体积；不能使用含游离生物素的溶液洗涤！

步骤 5：目标蛋白洗脱

1. 洗涤完成后，加入 1–2 倍柱体积【洗脱液 S1181-D】；

封闭柱子上下端，室温 / 冰上静置孵育 10–15 min；

打开下端堵头，收集流出液体，即为目标 Strep-tag II 融合蛋白；

2. 可重复洗脱 2 次，分次收集，提高总回收率；
注：洗脱液内含生物素，收集后的蛋白样品如需后续二次亲和纯化，建议透析去除生物素。 

步骤 6：填料再生与保存

1. 洗脱结束后，加入 3 倍柱体积结合液充分冲洗填料，去除残留生物素；

2. 长期保存建议置于使用含20%乙醇的结合液重悬填料，2–8℃避光保存；

3. 若结合能力明显下降：用3 CV的去离子水清洗，用5-15CV的20-100 mM NaOH再生，然后用3 CV的去离子水清洗后保存。

注：1. 本品不适用HABA再生。

2. 如纯化同一蛋白，只需用10CV结合缓冲液清洗柱子后添加保护液保存即可；如用于不同蛋白的纯化则需要对柱子进行重生处理，对柱子清洗3-5CV后，可参考步骤6中第3步的操作方式再生。

常见问题排查

1、目的蛋白完全不结合填料

1.1 核查标签序列：确认是 Strep-tagⅡ / Twin-Strep-tag；标签位置（N 端 / C 端）被蛋白空间结构包裹会造成结合失效；

1.2 上清 pH 偏离中性、样品含高浓度还原剂；

1.3 填料干涸失活、填料过期。

2、蛋白结合上去，但是洗脱不下来

2.1 洗脱液是否失效；洗脱孵育时间不足；

2.2 标签空间折叠紧密，可适当调整洗脱温度（室温孵育）。

3、纯化条带杂蛋白很多

3.1 洗涤体积不足；降低上样流速；增加洗涤次数；

3.2 菌体裂解上清含有大量细胞碎片，未充分离心过滤堵塞填料产生非特异性吸附。

4、柱子流速很慢、极易堵塞

4.1 裂解后上清没有充分澄清，残留细胞碎片；

4.2 操作过程填料受压压实，重力柱不要施加负压抽吸。

注意事项：

1. 溶菌酶固体粉末容易吸潮，密封 2–8℃保存；现配现用；

2. PMSF 具有毒性，操作佩戴手套；

3. 所有缓冲液避免引入游离生物素，会竞争性抑制蛋白结合；

4. 填料严禁冷冻、严禁高速剧烈离心；

5. 本试剂盒仅用于科研实验，不可用于临床诊断。