货号：M5125
存储条件：-20℃，有效期2年
产品组分
组分 | 规格 |
M-MLV GIV Reverse Transcriptase (200 U/μl) | 50ul |
5× M-MLV Buffer | 500ul |
0.1M DTT | 100ul |
产品说明
M-MLV GIV Reverse Transcriptase是通过基因修饰和重组技术获得的第四代M-MLV逆转录酶。该酶相对于野生型M-MLV逆转录酶去除了RNaseH活性，并大幅提高了热稳定性(最适反应温度为55°C)，70°C仍有50%活性，相较于前代酶进一步提高了对复杂二级结构的耐受性。该酶具有更快的反应速度，只需10分钟即可完成逆转录反应过程。该酶与模板亲和力更强，在低模板量或低拷贝模板时表现更佳。与此同时，该酶的全长cDNA合成能力也得到提升，最长可获得20kb的全长cDNA。
酶活定义
37°C条件下，以Poly(A)-Oligo(dT)为模板/引物，在10min内，掺入1nmol的[2H]dTTP所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。
质量控制
蛋白纯度
经SDS-PAGE凝胶电泳检测，蛋白纯度不低于95%。
核酸内切酶残留检测
将酶液与超螺旋质粒DNA在37°C温育4h，通过DNA电泳检测质粒无变化。
核酸外切酶残留检测
将酶液与双链DNA底物在37°C温育16h，通过DNA电泳检测双链DNA底物无变化。
宿主DNA残留检测
采用中国药典2020版四部通则3407外源性DNA残留量测定法第三法定量PCR法，本品中大肠杆菌宿主细胞DNA残留量低于1拷贝/200U。
使用方式
1、第一链cDNA合成
试剂 | 使用量 |
引物 | X ul |
Oligo(dT)20 终浓度2.5 μM | |
或随机引物 终浓度2.5 ng/μl | |
或基因特异性引物 终浓度0.25 μM | |
模板RNAa | 50 ng~2ug/20ul |
5× M-MLV Buffer | 4 ul |
0.1 M DTT | 1 ul |
M-MLV GIV Reverse Transcriptase (200 U/μl) | 1 ul |
dNTP Mix (10 mM Each) | 1 ul |
（可选）RNase Inhibitor (40 U/μl) | 1 ul |
Nuclease-Free Water | Up to 20ul |
a.推荐使用试剂盒提取的已去除基因组DNA污染的高质量RNA作为模板。
2. 轻柔吸打混匀后，瞬离；
3. 若使用Oligo(dT)20或基因特异性引物，55°C温育10 min；若使用随机引物，先25°C温育5min，之后55°C温育10min；
注：若目的cDNA小于3kb，温育时间可缩短为5min。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60°C~65°C。
4. 反应结束后，85°C温育5 min以终止反应；
5. 将获得的cDNA溶液置于冰上，用于后续实验。
注：cDNA溶液置于-20°C可保存半年；置于-80°C可长期储存。
