货号：R1190
存储条件：-20℃，12个月有效，冰袋运输。
产品组分
组分 | 50T | 100T |
胞浆蛋白提取试剂 | 15ml | 30ml |
胞核蛋白提取试剂 | 5ml | 10ml |
PMSF（100 mM） | 0.2ml | 0.4ml |
产品说明
胞浆与胞核蛋白的提取是 EMSA、IP、footprinting、酶活测定等实验能否成功的关键前提，但胞浆、胞核蛋白的成功提取并不容易。其难点在于，对于 EMSA、IP、footprinting、酶活测定等实验来说，提取的蛋白应保持相对完整的立体构象和功能活性，而一般蛋白提取使用的细胞裂解剂和表面活性剂常常会破坏蛋白的构象和活性。本试剂盒配置了温和的细胞膜与核膜裂解剂，不会破坏蛋白的立体构象，同时还配置了能够有效维持蛋白构象的抗变性剂和还原剂，有效解决了一般蛋白提取过程中蛋白质构象破坏和活性缺失的问题，特别适合于 EMSA、IP、footprinting、酶活测定、基因表达功能检测等对蛋白质构象和功能要求较高的研究。
试剂准备
1. 室温融解试剂盒中的三种试剂，融解后立即放置在冰上，混匀。
2. 胞质蛋白提取液：取适量的胞浆蛋白提取试剂，在使用前数分钟内加入 PMSF，使 PMSF 的最终浓度为 1 mM。
3. 胞核蛋白提取液：取适量的胞核蛋白提取试剂，在使用前数分钟内加入 PMSF，使 PMSF 的最终浓度为 1 mM。
操作步骤
一、细胞样品（贴壁细胞/悬浮细胞）
1、贴壁细胞前处理：
1.1 取出细胞培养板，吸去培养液，用 2-8 ℃预冷的 PBS（0.01M，pH7.4）或生理盐水清洗细胞两次，清洗完后彻底吸弃 PBS 或生理盐水。
1.2 用刮板刮下细胞，或用 0.02%EDTA 溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，吸弃上清，保留细胞沉
淀。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需提取的目的蛋白。
2、悬浮细胞前处理：
2.1 将悬浮细胞转移至洁净离心管内，4 ℃，800 g 离心 5 min，使细胞沉淀在离心管底，彻底吸弃上清液，加入细胞沉淀 5 倍量的预冷 PBS
或生理盐水，温和手振 30s，使细胞充分散开。
2.2 在 4 ℃下，800 g 离心 5 min，吸弃上清，保留细胞沉淀。
3、细胞质蛋白提取：向细胞沉淀中加入 5 倍细胞体积预冷胞质蛋白提取液，强烈涡旋震荡 5s，冰浴孵育 15 min，期间每隔 5 min 用移液器
吹打 10 次；随后 13000 g、4 ℃离心 10 min，上清即为细胞质蛋白，将其转移到干净的 EP 管中，所余沉淀即为细胞核。
4、细胞核裂解：向细胞核沉淀中加入 2 倍细胞体积（注意为 2 倍细胞体积，非细胞核沉淀体积）的预冷胞核蛋白提取液，强烈涡旋震荡 15s 至沉淀完全分散，冰浴孵育 30 min，期间每 10 min 用移液器吹打 10 次；16000 g、4 ℃离心 20 min，上清即为细胞核蛋白，转移到干净的
EP 管中保存。
二、组织样品
1、取新鲜组织，用预冷的 PBS 或生理盐水反复清洗至无明显血迹，将组织剪成 2-3 mm³的小块，转移至玻璃匀浆器中。
2、按每 50 mg 组织加入 200 μL 预冷的胞质蛋白提取液，在冰浴条件下用玻璃匀浆器充分匀浆，直至无肉眼可见的组织团块。
3、匀浆后把匀浆液转移到干净的 EP 管内，冰浴放置 15 min。
4、4 ℃，13000g 离心 5 min。把上清转移至一预冷的 EP 管中，即为提取得到的胞浆蛋白，所余沉淀即为细胞核沉淀。（注：吸上清时千万
不要触及沉淀）
5、细胞核裂解：向细胞核沉淀中加入 2 倍组织体积的预冷胞核蛋白提取液，强烈涡旋震荡 15s 至沉淀完全分散，冰浴孵育 30 min，期间每
10 min 用移液器吹打 10 次；16000 g、4 ℃离心 20 min，上清即为细胞核蛋白，转移到干净的 EP 管中保存。
三、注意事项：
1、PMSF 水溶液易失效，需在提取试剂加入样品前 2-3min 内完成添加，不要过早加入，确保抑制效果。
2、蛋白提取的所有操作步骤均需在冰上或 4℃低温环境下进行，避免蛋白降解。
3、推荐使用新鲜组织作为提取样品。
4、蛋白浓度检测不建议使用普通 Bradford 法，推荐采用 BCA 法，检测结果更准确。
免疫沉淀常见问题
一、 对应标签的衍生物是否可以识别？
GFP: GFP、EGFP、YFP 和 EYFP 等
RFP: RFP/mcherry
MYC: 识别位于融合蛋白N-端、C-端及内部的Myc-tag。不结合内源性c-Myc
二、 是否会出现轻重链污染的情况呢？
我们LABLEAD的beads是基于纳米抗体（为IgG抗体的重链可变区，大小只有15KD）制成的，一般用传统的抗体会出现轻重链污染是由于传统抗体变性沉淀后会出现的重链（50kDa）和轻链（25kDa）两条带，导致结果受到影响，而我们的纳米抗体大小只有15KD，特异性高，不会出现这种污染的情况。
三、如何选择beads的类型，是选择磁珠的，还是琼脂糖的呢？
选琼脂糖珠或者磁珠都可以得到较好的结果，只是在操作上有一些细微差别（请参照说明书），相对来说琼脂糖的更便宜些，如果是大量样本可以选择琼脂糖珠的。
四、应该选择哪种洗脱方式？
1、变性洗脱：添加loading buffer后煮沸，再进行电泳或者WB检测
2、酸洗脱（非变性）：利用0.2M 甘氨酸洗脱，洗脱后添加pH10.0 的tris进行中和，目前已验证我们的beads可以不进行后续的中和步骤，客户可以用PBS多清洗几次后就可以重复使用了
3、多肽洗脱（非变性）：利用标签蛋白相同的多肽进行竞争洗脱
以上三种方式，客户只做检测不回收beads推荐用方式1；
需要重复使用beads 或者保持蛋白活性，推荐用方式 2或者3；
免疫沉淀试剂盒中含有的洗脱液E组分为
多肽洗脱产品：F1001（flag）
五、没有目的条带、条带弱
1..蛋白表达量太低或降解
内源表达低，裂解时被蛋白酶降解，可以加蛋白酶抑制剂，提高上样量，缩短处理时间。
2.抗体不合适
用了不识别天然构象的抗体（只识别变性抗原）；
抗体效价低、种属不匹配，建议客户换IP 级 / 天然构象抗体，同时看阳性对照的结果
3.洗涤过强
高盐、高去垢剂把结合蛋白洗掉，建议→ 减少洗涤次数，降低洗涤液盐浓度
六、非特异性条带多/背景高
1.减少beads量
2.缩短孵育时间
3.裂解液和漂洗液中加5-10%甘油或1%的triton X-100
七、input有条带，IP没有条带/没有检测到目的蛋白
1.样本中目的蛋白不表达或低水平表达，如果表达水平低，需要增加裂解液用量，但也可能导致非特异结合的增加，所以在免疫沉淀之前需要预先清除裂解液。
2.beads用量不够，检查beads用量，提高使用量。
3.目标蛋白没有从磁珠上洗脱，需要确保使用的洗脱缓冲液正确。
4.裂解液中盐碱度太高，需要改用低盐碱度裂解液。一般可选NP-40，RIPA，western及IP细胞裂解液。
八、再生
Flag抗DYKDDDDK beads的再生：
抗DYKDDDDK beads可以多次重复使用，以纯化flag标签不同融合蛋白
若在一段时间内纯化同一蛋白，则无需再生。
再生步骤：
1. 用2个体积的0.1M Tris-HCl、0.5M NaCl、pH 12.0溶液洗涤beads。
2.用3-5体积的TBS或者PBS重新平衡beads。
3.对于短期储存，beads可以在2-8°C下储存在含有0.02%叠氮化钠的TBS或PBS中，或者储存在含有50%甘油和0.02%叠氮化钠的TBS或PBS中，温度为-20°C。Beads可以循环使用至少4次。如果维护得当，结合能力损失最小。
九、proteinA/G常见问题
1. 抗体的选择
IP 抗体：尽量选择可用于IP的抗体，一般IP抗体识别的蛋白质三级空间结构的位点，而WB抗体只需识别线性结构位点，当说明书未表明能做IP时优先选能做免疫组化或免疫荧光的抗体
WB一抗：选择与IP抗体来源不同的抗体可避免轻重链污染
2.轻重链污染的原因？如何避免轻重链污染？
原因：WB检测的二抗与IP时的抗体结合导致曝光出条带（大约在25KD、55KD）
解决方案：
在IP洗脱方式采用酸洗脱；
IP抗体和WB一抗选用不同来源的；
IP抗体用纳米抗体形式。
3.无信号
a.蛋白未表达或者表达量很低
确定蛋白是否表达以及表达量，增加样本量并进行预处理
b.裂解不充分导致蛋白未释放
更换合适的裂解液或优化裂解配方
c.抗体失效
确认抗体效期、通过WB来验证抗体效果
d.蛋白未被洗脱
调整洗脱液的pH或者浓度
e.抗体与珠子未结合
更换合适的珠子
4.背景深
a.蛋白样品中可能有不容易溶解的大蛋白复合物等
样本裂解后超声处理（参考条件：5s，3次）
添加Dnase I 降解基因组（可能是强效裂解液导致基因组释放）
b.抗体特异性不好
更换抗体，尽量选择单克隆抗体
c.IP抗体的量太多
优化条件
d.目的蛋白可能降解了
样本中及时添加蛋白酶抑制剂
使用新提的样本
e.样本量多导致的蛋白沉beads
增加洗杂缓冲液盐浓度
漂洗液中添加5%甘油或0.1% Triton X-100
优化样本量，建议使用100-500ug细胞裂解样本
5.igg阴性对照有条带
a. beads先连抗体再连蛋白
b. 用高盐的漂洗液，增加漂洗次数。
c. beads连抗体之前封闭30min-1h
