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免疫沉淀常见问题

一、 对应标签的衍生物是否可以识别？

GFP: GFP、EGFP、YFP 和 EYFP 等  

RFP: RFP/mcherry      

MYC: 识别位于融合蛋白N-端、C-端及内部的Myc-tag。不结合内源性c-Myc

二、 是否会出现轻重链污染的情况呢？

我们LABLEAD的beads是基于纳米抗体（为IgG抗体的重链可变区，大小只有15KD）制成的，一般用传统的抗体会出现轻重链污染是由于传统抗体变性沉淀后会出现的重链（50kDa）和轻链（25kDa）两条带，导致结果受到影响，而我们的纳米抗体大小只有15KD，特异性高，不会出现这种污染的情况。

三、如何选择beads的类型，是选择磁珠的，还是琼脂糖的呢？

选琼脂糖珠或者磁珠都可以得到较好的结果，只是在操作上有一些细微差别（请参照说明书），相对来说琼脂糖的更便宜些，如果是大量样本可以选择琼脂糖珠的。

四、应该选择哪种洗脱方式？

1、变性洗脱：添加loading buffer后煮沸，再进行电泳或者WB检测

2、酸洗脱（非变性）：利用0.2M 甘氨酸洗脱，洗脱后添加pH10.0 的tris进行中和，目前已验证我们的beads可以不进行后续的中和步骤，客户可以用PBS多清洗几次后就可以重复使用了

3、多肽洗脱（非变性）：利用标签蛋白相同的多肽进行竞争洗脱

以上三种方式，客户只做检测不回收beads推荐用方式1；

需要重复使用beads 或者保持蛋白活性，推荐用方式 2或者3；

免疫沉淀试剂盒中含有的洗脱液E组分为

多肽洗脱产品：F1001（flag）

五、没有目的条带、条带弱

1..蛋白表达量太低或降解

内源表达低，裂解时被蛋白酶降解，可以加蛋白酶抑制剂，提高上样量，缩短处理时间。

2.抗体不合适

用了不识别天然构象的抗体（只识别变性抗原）；

抗体效价低、种属不匹配，建议客户换IP 级 / 天然构象抗体，同时看阳性对照的结果

3.洗涤过强

高盐、高去垢剂把结合蛋白洗掉，建议→ 减少洗涤次数，降低洗涤液盐浓度

六、非特异性条带多/背景高

1.减少beads量

2.缩短孵育时间

3.裂解液和漂洗液中加5-10%甘油或1%的triton X-100

七、input有条带，IP没有条带/没有检测到目的蛋白

1.样本中目的蛋白不表达或低水平表达，如果表达水平低，需要增加裂解液用量，但也可能导致非特异结合的增加，所以在免疫沉淀之前需要预先清除裂解液。

2.beads用量不够，检查beads用量，提高使用量。

3.目标蛋白没有从磁珠上洗脱，需要确保使用的洗脱缓冲液正确。

4.裂解液中盐碱度太高，需要改用低盐碱度裂解液。一般可选NP-40，RIPA，western及IP细胞裂解液。

八、再生

Flag抗DYKDDDDK beads的再生：

抗DYKDDDDK beads可以多次重复使用，以纯化flag标签不同融合蛋白

若在一段时间内纯化同一蛋白，则无需再生。

再生步骤：

1. 用2个体积的0.1M Tris-HCl、0.5M NaCl、pH 12.0溶液洗涤beads。

2.用3-5体积的TBS或者PBS重新平衡beads。

3.对于短期储存，beads可以在2-8°C下储存在含有0.02%叠氮化钠的TBS或PBS中，或者储存在含有50%甘油和0.02%叠氮化钠的TBS或PBS中，温度为-20°C。Beads可以循环使用至少4次。如果维护得当，结合能力损失最小。

九、proteinA/G常见问题

1. 抗体的选择

IP 抗体：尽量选择可用于IP的抗体，一般IP抗体识别的蛋白质三级空间结构的位点，而WB抗体只需识别线性结构位点，当说明书未表明能做IP时优先选能做免疫组化或免疫荧光的抗体

WB一抗：选择与IP抗体来源不同的抗体可避免轻重链污染

2.轻重链污染的原因？如何避免轻重链污染？

原因：WB检测的二抗与IP时的抗体结合导致曝光出条带（大约在25KD、55KD）

解决方案：

在IP洗脱方式采用酸洗脱；

IP抗体和WB一抗选用不同来源的；

IP抗体用纳米抗体形式。

3.无信号

a.蛋白未表达或者表达量很低

确定蛋白是否表达以及表达量，增加样本量并进行预处理

b.裂解不充分导致蛋白未释放

更换合适的裂解液或优化裂解配方

c.抗体失效

确认抗体效期、通过WB来验证抗体效果

d.蛋白未被洗脱

调整洗脱液的pH或者浓度

e.抗体与珠子未结合

更换合适的珠子

4.背景深

a.蛋白样品中可能有不容易溶解的大蛋白复合物等

样本裂解后超声处理（参考条件：5s，3次）

添加Dnase I 降解基因组（可能是强效裂解液导致基因组释放）

b.抗体特异性不好

更换抗体，尽量选择单克隆抗体

c.IP抗体的量太多

优化条件

d.目的蛋白可能降解了

样本中及时添加蛋白酶抑制剂

使用新提的样本

e.样本量多导致的蛋白沉beads

增加洗杂缓冲液盐浓度

漂洗液中添加5%甘油或0.1% Triton X-100

优化样本量，建议使用100-500ug细胞裂解样本

5.igg阴性对照有条带

a. beads先连抗体再连蛋白

b. 用高盐的漂洗液，增加漂洗次数。

c. beads连抗体之前封闭30min-1h