货号：C0489
储存条件：储存于4ºC，其中A组分需避光，有效期见外包装。
产品内容：
组分 | C0489(25T) | C0489 (100T) |
A. SuperView 488 Caspase-3 Substrate, 0.2 mM in DMSO | 125 μL | 500 μL |
B. Caspase-3 inhibitor Ac-DEVD-CHO, 2 mM in DMSO | 20 μL | 100 μL |
产品介绍
SuperView 488 Caspase-3 活细胞分析试剂盒包含 SuperView 488 Caspase-3 底物和 Ac-DEVD-CHO Caspase-3 抑制剂。 SuperView 488 Caspase-3 Substrate 为基于 Caspase-3 活力检测细胞凋亡提供了有效的工具，适用于荧光显微术和流式细胞术。相比其他基于(FLICA) 分析的 Caspase 的荧光底物或荧光抑制剂， SuperView 488 Caspase-3 Substrate 检测 Caspase-3 活 性的同时不会抑制完整细胞的凋亡过程。
Substrate 由耦合 Caspase-3 DEVD 识别序列的荧光 DNA 染料组成。 Substrate 最初无荧光，穿过细胞膜进入细胞质。在 凋亡细胞中， Caspase-3 剪切 Substrate，释放高亲和性的 DNA 染色， 这种染料迁移到细胞核标记 DNA 并发出明亮的绿色荧 光。因此， SuperView 488 Caspase-3 Substrate 是双功能的，既可以检测 Caspase-3 活性，又可视化细胞核在细胞凋亡进行中 的形态学变化。 SuperView 488 染色可以甲醛固定并兼容后续免疫染色实验。
光谱特性
SuperView 488：Ex/Em = 500/530 nm (with DNA)
使用方法
1. 实验优化
下面提供的实验步骤根据终点法检测制度。 SuperView 488 Substrate 也可以进行细胞长时间孵育课程研究。细胞密度、 底物浓度和抑制剂浓度可能需要优化。最佳底物浓度可能在 1- 10 μM 之间。细胞可以在培养基、 PBS 或其他您所选择的缓冲 液中孵育底物。对于贴壁细胞， 我们建议更换新鲜含有底物的培养基， 以防背景的不均一性。底物孵育后换液或洗涤细胞的 操作是自由选择的。
2. 对照
我们建议您设定以下对照：
A. 阴性对照：不诱导凋亡的细胞；
B. 阳性对照：诱导凋亡的细胞；
C. 抑制剂对照：诱导细胞凋亡同时(或提前 10-30 min)孵育 Caspase-3/7 抑制剂，最后再添加 SuperView 488 Caspase-3 底物。
3. Ac-DEVD-CHO Caspase-3 抑制剂对照
试剂盒中的 Caspase-3/7 抑制剂 Ac-DEVD-CHO 可以用来确认 Caspase-3/7 依赖于 Superview 488 的荧光信号。对于抑制剂对照，抑制剂的终浓度应该至少是底物浓度的 2 倍(例如当使用 5 μM SuperView 488 底物时， Ac-DEVD-CHO 浓度为10μM) 。添加底物前在室温下孵育 Ac-DEVD-CHO 15-30 min，加入底物后， 孵育液中继续保留抑制剂。 Ac-DEVD-CHO 是可 逆的竞争性抑制剂。在某些细胞类型， 有效的 Caspase-3/7 抑制剂需要使用不可逆的抑制剂， 如 Z-DEVD-FMK，或需要在凋 亡诱导之前或诱导过程中添加抑制剂。
4. 流式细胞术
(1) 选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经处理的细胞样本作为对照。
(2) 贴壁细胞，执行 SuperView 488 Caspase-3 实验前先用胰蛋白酶或其他方法消化细胞。
(3) 用培养基或缓冲液重悬细胞，使细胞密度为 106 个/mL
(4) 吸取 0.2 mL 细胞悬液至流式细胞试管。
(5) 抑制剂对照样本，用 Ac-DEVD-CHO 处理细胞(见上文 3. Ac-DEVD-CHO Caspase-3 抑制剂对照)。
(6) 200 μL 细胞悬液中加入 5 μL 0.2 mM 的 Substrate 并立即混匀使底物浓度为 5 μM。不同细胞的最佳底物浓度可能不同， 需分析优化。
(7) 室温避光孵育细胞 15-30 min。
(8) 加入 300 μL 培养基或 PBS，流式细胞仪分析。检测绿色荧光的通道(Ex/Em = 485/515 nm)。
5. 荧光显微镜
(1) 选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经处理的细胞样本作为对照。
(2) 抑制剂对照样本，用 Ac-DEVD-CHO 处理细胞(见上文 3. Ac-DEVD-CHO Caspase-3 抑制剂对照)。
(3) 用含有 5 μM Substrate 的新鲜培养基或 PBS 对细胞进行换液(见上文 1. 实验优化) 。对于抑制剂对照组， 抑制剂与底 物一同孵育。
(4) 室温下孵育细胞 30 min 或更长时间。
(5) 细胞可以在含有 Substrate 的培养基中直接观察。对于终点分析法， PBS 清洗细胞，荧光显微镜观察细胞， 使用观察绿 色荧光的滤片(Ex/Em = 485/515 nm)。
6. 荧光酶标仪
(1) 贴壁细胞生长在黑色 96 孔板中；悬浮细胞，调整密至 106 个/mL ，0.2 mL 细胞悬液分装到一孔。
(2) 选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经处理的细胞样本作为对照。 注：细胞可能在管或瓶中处理，然后转移到 96 孔检测板。
(3) 抑制剂对照样本，用 Ac-DEVD-CHO 处理细胞(见上文 3. Ac-DEVD-CHO Caspase-3 抑制剂对照)。
(4) 对于悬浮细胞，直接添加 Substrate 混匀。对于贴壁细胞，用含有 5 μM Substrate 的新鲜培养基或PBS 对细胞进行换液 (见上文 1. 实验优化)。对于抑制剂对照组，抑制剂与底物一同孵育。
(5) 细胞可以在含有 Substrate 的培养基中直接观察。
(6) 对于悬浮细胞，轻轻摇晃重悬细胞。荧光酶标仪设置激发波长 488 nm 和发射波长 520 nm 。建议贴壁细胞使用底部采集方式。贴壁细胞密度的变化可能导致不准确的读数。
注意事项
1. 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。
2. 细胞可以用终浓度为 1 μM 的 Hoechst 33342 染料共同染色，使细胞核产生蓝色荧光染色(Ex/Em = 346/460 nm)。
3. SuperView 488 染色可以被甲醛固定，但与甲醇固定不兼容。
4. 甲醛固定的 SuperView 488 染色细胞可以用 0. 1% TritonX- 100 处理后进行后续染色，但处理后的染色的亮度可能会减弱。
5. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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