产品货号：H1032

储存条件：4℃保存

产品组分

产品简介

His标签蛋白纯化试剂盒（His-tag Protein Purification Kit），或者镍柱试剂盒，是一种可以兼容高浓度变性剂(8M尿素或6M盐酸胍)，简单、快速、灵活、高效并且高特异性地在非变性条件下纯化His标签蛋白的试剂盒。本试剂盒中包含了His标签蛋白所需的相关试剂和亲和层析柱空柱管，为His标签蛋白的纯化带来了极大的便利。

本试剂盒用于非变性条件纯化His标签蛋白，试剂盒中提供非变性His标签蛋白纯化所需的裂解液、洗涤液和洗脱液，可以很好地满足实验的需要。

注意事项：

1、试剂盒中的Ni NTA Beads 6FF体积10ml为纯beads体积，总体积20ml（保护液为20%乙醇溶液）使用前需要充分混合均匀；

2、对于包涵体蛋白的纯化，在采用8M尿素或6M盐酸胍溶解蛋白的情况下，需通过透析去除尿素和盐酸胍后才能使用本产品进行His标签蛋白的纯化。

3、请勿在-20ºC或更低温度冷冻保存Ni NTA Beads 6FF。

4、若离心不能完全除去蛋白样品中的不溶物，可以将样品溶液用0.45µm的滤膜过滤。

5、若使用本说明书提供的条件无法达到理想的纯化效果，可尝试改变洗涤液和洗脱液中咪唑的浓度和(或)pH，以达到最优效果。

6、为了安全您请穿实验服戴一次性手套操作。

说明：

对于用镍柱纯化大肠杆菌中His标签蛋白比较熟悉的使用者可参考“4. 简化的操作流程”。

本说明书以最常见的大肠杆菌中表达纯化His标签重组蛋白为例，说明使用方法。在其它体系中表达时，请参考该表达体系的相关使用说明，可借鉴大肠杆菌中纯化His标签重组蛋白的使用说明

实验步骤

1. 大肠杆菌中可溶性His标签重组蛋白的诱导表达：

以最常用的IPTG诱导表达系统为例，诱导表达条件的优化可参照所使用的诱导表达体系的说明。其它诱导表达系统请参考适当的使用说明进行。

a. 挑取表达His标签重组蛋白的单克隆，接种到3ml或10-20ml含适当抗生素的LB培养液中，培养过夜。

b. 按照1:20的比例取培养过夜的菌液，接种到预热至37ºC并含适当抗生素的LB培养液中。如取5ml培养过夜的菌液接种到100ml预热至37ºC并含适当抗生素的LB培养液中。具体的培养体积视需要纯化的蛋白量而定，初步的鉴定培养3-10ml即可；常规的表达纯化，通常可考虑培养100-200ml；制备型的纯化，培养体积可以达到1L或更大。如果希望取得更好的表达效果，建议按照1:100的比例接种过夜培养的菌液，但后续培养至相应的OD值需要更长的时间。

c. 37ºC常规培养约30-60min或更长时间，至菌液的OD600达到0.5-0.7，并且OD600最好接近0.6。

d. 加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养4-5小时。

注：可以在加入IPTG前取出少量菌液同样培养4-5小时后作为未诱导的对照，也可以在加入IPTG前直接取出少量菌液作为未诱导的对照。对于特定蛋白的诱导表达，最佳的IPTG浓度、诱导温度、和诱导时间需通过实验确定。

e. 收集菌液至离心管中，4ºC 4,000g离心20min或4ºC 15,000g离心1min，弃上清，收集沉淀。随后即可进入细菌裂解步骤，也可在-20ºC或-80ºC冻存备用。冷冻保存的菌体使用前需置于冰上解冻15min。

2. 非变性条件下His标签蛋白的小量纯化：

此法常用于小量样品的快速分析和鉴定

a. 接步骤 1(e)，离心收集 1ml 菌液的细菌沉淀并弃上清，加入100µl Lysis buffer，将细菌沉淀充分重悬于裂解液中，可进行轻微的 vortex(尽量避免产生气泡)。

注：根据His标签重组蛋白表达的丰度，菌液和裂解液的体积比可以在25:1-5:1范围内适当调整。表达丰度非常高时，每毫升菌液沉淀可以加入200µl Lysis buffer；表达丰度非常低时，每毫升菌液沉淀可以加入40µl Lysis buffer。试剂盒中裂解液可以确保裂解绝大多数可溶性蛋白和包涵体蛋白，裂解后可以直接用于SDS-PAGE。如有必要，可在裂解细菌之前，在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物。

b. 加入溶菌酶至1mg/ml并轻轻混匀，尽量避免产生气泡，冰水浴或冰上放置30min。 注：溶菌酶可以用裂解液配制成100mg/ml的母液，临使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以适当分装后-20ºC保存。

c. 轻轻vortex数下，以充分裂解细菌，尽量避免产生气泡。

d. 4ºC离心(15000g×10min)，取10µl上清留样作后续检测用，收集余下上清至一新的洁净离心管中。

e. 加入20µl混合均匀的Ni NTA Beads 6FF，4ºC在摇床上缓慢摇动30min，以充分结合带His标签的目的蛋白。

注：缓慢摇动30min已经可以确保蛋白充分结合，但可以根据时间安排的需要缓慢摇动更长时间甚至缓慢摇动过夜。根据经验，直接使用Ni NTA Beads 6FF也能获得良好的纯化效果。但如希望获得更高的标签蛋白得率，可以参考步骤3f，用一个柱体积的Lysis buffer平衡Ni NTA Beads 6FF 2-3次。

f. 4ºC离心(1000g×10s)沉淀凝胶，取20µl上清留样作后续检测用，其余上清弃去。

g. 加入40µl washing buffer重悬凝胶，4ºC离心(1000g×10s)，取20µl上清留样作后续检测用，其余上清弃去。

h. 重复步骤g，再进行一次洗涤。

i. 加入20µl elution buffer，轻轻重悬凝胶。4ºC离心(1000g×10s)，收集上清及凝胶。上清即为纯化获得的带有His标签的目的蛋白。

j. 重复步骤i两次。共洗脱收集约60µl纯化的蛋白样品。

3. 非变性条件下His标签蛋白的大量纯化： 

a. 接步骤1(e)，对于新鲜的或解冻的细菌沉淀，按照每克细菌沉淀湿重加入4ml(2-5ml均可) Lysis buffer的比例加入裂解液，充分重悬菌体。如有必要，可以在裂解细菌之前，在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物。

b. 加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml并混匀，冰水浴或冰上放置30min。 注：溶菌酶可以用裂解液配制成100mg/ml的母液，临使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以适当分装后-20ºC保存。

c. 冰上超声裂解细菌。超声功率200-300W，每次超声处理10s，每次间隔10s，共超声处理6次。

注：具体超声处理的方式须根据特定型号的超声仪器自行摸索和优化。

d.  (可选做)如超声处理后裂解液非常粘稠，可以加入RNase A至10µg/ml及DNase I至5µg/ml，冰上放置10-15min。或者使用适当的装好了较细针头的注射器，反复抽吸数次以剪切粘稠的基因组DNA等。

e.  4ºC 10,000g离心20-30min，收集细菌裂解液上清并置于冰水浴或冰上。可以取20µl上清留作后续检测用。

注：上清必须保持澄清（即不含任何不溶物），才能进行下一步的纯化。上清中如混有不溶性杂质会严重影响后续纯化获得蛋白的纯度。

f. 取1ml混合均匀的Ni NTA Beads 6FF，4ºC离心(1000g×10s)弃去储存液，向凝胶中加入0.5ml Lysis buffer混匀以平衡凝胶，4ºC离心(1000g×10s)弃去液体，再重复重复平衡1-2次，弃去液体。将约4ml 细菌裂解液上清加入其中，4ºC在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动60min。

注：Ni NTA Beads 6FF也可不平衡直接使用，但蛋白的得率有可能会有5-20%的下降。

g. 将Lysis buffer和Ni NTA Beads 6FF的混合物装入试剂盒提供的亲和层析柱空柱管中。

注：也可先取1ml混合均匀的Ni NTA Beads 6FF装柱，然后用0.5ml Lysis buffer平衡2-3次后加入约4ml细菌裂解液上清，后续可以将穿流液收集后重复上柱3-5次以充分结合目的蛋白。先混合后装柱的方式操作起来相对麻烦，但更有利于带有His标签重组蛋白与镍柱的充分结合，特别是当His标签被蛋白本身部分遮挡或His标签重组蛋白浓度很低时与镍柱的结合效率会高一些。 

h. 将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出，收集约20微升穿流液作后续分析用。

i. 洗柱5次，每次加入0.5-1ml washing buffer，每次均收集约20微升穿柱的洗涤液用于后续的分析检测用。洗柱及下一步洗脱过程中可以用Bradford法检测每次洗涤液和洗脱液中的蛋白含量，从而考虑增加或减少洗涤和洗脱的次数。

注：如果出现后续获得蛋白纯度不够高的情况，可以再增加洗柱次数2-3次。

j. 洗脱目的蛋白6-10次，每次用0.5ml elution buffer。将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中。收集获得的洗脱液即为纯化的His标签蛋白样品。

4. 简化的操作流程：

a. 细菌中的目的蛋白诱导表达后，离心沉淀细菌。

b. 每克细菌沉淀湿重加入4ml Lysis buffer，可添加适量蛋白酶抑制剂，充分重悬细菌。

c. 加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml并混匀，冰水浴或冰上放置30min。

注：溶菌酶可以用裂解液配制成100mg/ml的母液，临使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以适当分装后-20ºC保存。

d. 冰上超声裂解细菌，离心取上清。

e. Ni NTA 6FF装柱，1ml Lysis buffer平衡纯化柱2次。

f. 步骤4d中的上清上柱。

注：上清上柱是可以收集穿流液并重复上柱3-5次，以充分结合His标签蛋白。

g. 用0.5ml washing buffer洗柱5次。

注：如果出现咪唑浓度偏低的情况，可以自行添加适量咪唑，如果出现咪唑浓度偏高的情况，可以使用试剂盒提供的Lysis buffer作为洗涤液使用。

h. 用0.5ml elution buffer洗脱6-10次。