产品货号：H1035
储存条件：4℃保存，有效期 1年
产品组分
产品编号 | 名称 | 规格 |
N30210 | Ni NTA Beads 6FF 镍填料 | 10ml（beads） |
H1032A | Lysis buffer | 200ml |
H1032B | washing buffer | 200ml |
H1032C | Elution buffer | 50ml |
H1032D | 溶菌酶 | 100mg |
H1032E | 核酸去除试剂 | 100ml |
AC003 | 3ml AC空柱 重力柱 | 10套 |
产品简介
His标签蛋白纯化试剂盒，也称镍柱试剂盒，是一种可以兼容高浓度变性剂(8M尿素或6M盐酸胍)，简单、快速、灵活、高效且高特异性地在非变性条件下纯化His标签蛋白的试剂盒。
本试剂盒中包含了His标签蛋白所需的相关试剂和亲和层析柱空柱管、非变性His标签蛋白纯化所需的裂解液、洗涤液和洗脱液，并且含有核酸去除试剂，可以很好地满足去除核酸纯化蛋白的实验需求。
注意事项：
1、试剂盒中的Ni NTA Beads 6FF体积10ml为beads体积，总体积20ml（保护液为20%乙醇溶液）使用前需要充分混合均匀；
2、对于包涵体蛋白的纯化，在采用8M尿素或6M盐酸胍溶解蛋白的情况下，需通过透析去除尿素和盐酸胍后才能使用本产品进行His标签蛋白的纯化。
3、请勿在-20ºC或更低温度冷冻保存Ni NTA Beads 6FF。
4、若离心不能完全除去蛋白样品中的不溶物，可以将样品溶液用0.45µm的滤膜过滤。
5、若使用本说明书提供的条件无法达到理想的纯化效果，可尝试改变洗涤液和洗脱液中咪唑的浓度和(或)pH，以达到最优效果。
6、为了您请穿实验服戴一次性手套操作。
说明：
如对于用镍柱纯化大肠杆菌中His标签蛋白比较熟悉，可参考“4. 简化的操作流程”。
本说明书以最常见的大肠杆菌中表达纯化His标签重组蛋白为例，说明使用方法。在其它体系中表达时，请参考该表达体系的相关使用说明，可借鉴大肠杆菌中纯化His标签重组蛋白的使用说明。
实验步骤
1. 大肠杆菌中可溶性His标签重组蛋白的诱导表达：
以最常用的IPTG诱导表达系统为例，诱导表达条件的优化可参照所使用的诱导表达体系的说明。其它诱导表达系统请参考适当的使用说明进行。
a. 挑取表达His标签重组蛋白的单克隆，接种到3ml或10-20ml含适当抗生素的LB培养液中，培养过夜。
b. 按照1:20的比例取培养过夜的菌液，接种到预热至37ºC并含适当抗生素的LB培养液中。如取5ml培养过夜的菌液接种到100ml预热至37ºC并含适当抗生素的LB培养液中。具体的培养体积视需要纯化的蛋白量而定，初步的鉴定培养3-10ml即可；常规的表达纯化，通常可考虑培养100-200ml；制备型的纯化，培养体积可以达到1L或更大。如果希望取得更好的表达效果，建议按照1:100的比例接种过夜培养的菌液，但后续培养至相应的OD值需要更长的时间。
c. 37ºC常规培养约30-60min或更长时间，至菌液的OD600达到0.5-0.7，并且OD600最好接近0.6。
d. 加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养4-5小时。
注：可以在加入IPTG前取出少量菌液同样培养4-5小时后作为未诱导的对照，也可以在加入IPTG前直接取出少量菌液作为未诱导的对照。对于特定蛋白的诱导表达，最佳的IPTG浓度、诱导温度、和诱导时间需通过实验确定。
e. 收集菌液至离心管中，4℃ 4,000g离心20min或4℃ 15,000g离心1min，弃上清，收集沉淀。随后即可进入细菌裂解步骤，也可在-20℃或-80℃冻存备用。冷冻保存的菌体使用前需置于冰上解冻15min。
2. 非变性条件下His标签蛋白的小量纯化：
此法用于小量样品的快速分析和鉴定
a. 接步骤 1(e)，离心收集 1ml 菌液的细菌沉淀并弃上清，加入100µl Lysis buffer，将细菌沉淀充分重悬于裂解液中，可进行轻微的 vortex(尽量避免产生气泡)。
注：根据His标签重组蛋白表达的丰度，菌液和裂解液的体积比可以在25:1-5:1范围内适当调整。
表达丰度非常高时，每毫升菌液沉淀可以加入200µl Lysis buffer；表达丰度非常低时，每毫升菌液沉淀可以加入40µl Lysis buffer。试剂盒中裂解液可以确保裂解绝大多数可溶性蛋白和包涵体蛋白，裂解后可以直接用于SDS-PAGE。如有必要，可在裂解细菌之前，在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物。
b. 加入溶菌酶至1mg/ml并轻轻混匀，尽量避免产生气泡，冰水浴或冰上放置30min。
注：溶菌酶可用裂解液配制成100mg/ml的母液，临使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以适当分装后-20ºC保存。
c. 轻轻vortex数下，以充分裂解细菌，尽量避免产生气泡。
d. 4ºC离心(15000g×10min)，取10µl上清留样作后续检测用，收集余下上清至一新的洁净离心管中。
e. 加入20µl混合均匀的Ni NTA Beads 6FF，4ºC在摇床上缓慢摇动30min，以充分结合带His标签的目的蛋白。
注：缓慢摇动30min可以确保蛋白充分结合，也可根据需要缓慢摇动更长时间甚至缓慢摇动过夜。根据经验，直接使用Ni NTA Beads 6FF也能获得良好的纯化效果。但如希望获得更高的标签蛋白得率，可以参考步骤3f，用一个柱体积的Lysis buffer平衡Ni NTA Beads 6FF 2-3次。
f. 4ºC离心(1000g×10s)沉淀凝胶，取20µl上清留样作后续检测用，其余上清弃去。
g. 加入40µl washing buffer重悬凝胶，4ºC离心(1000g×10s)，取20µl上清留样作后续检测用，其余上清弃去。
h. 重复此步骤，再进行一次洗涤。
i. 加入100ul除核酸试剂进行除核酸，重复一次。
j. 加入20µl elution buffer，轻轻重悬凝胶。4ºC离心(1000g×10s)，收集上清及凝胶。上清即为纯化获得的带有His标签的目的蛋白。
k. 重复步骤i两次。共洗脱收集约60µl纯化的蛋白样品。
3. 非变性条件下His标签蛋白的大量纯化：
a. 接步骤1(e)，对于新鲜的或解冻的细菌沉淀，按照每克细菌沉淀湿重加入4ml(2-5ml均可) Lysis buffer的比例加入裂解液，充分重悬菌体。如有必要，可以在裂解细菌之前，在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物。
b. 加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml并混匀，冰水浴或冰上放置30min。 注：溶菌酶可以用裂解液配制成100mg/ml的母液，临使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以适当分装后-20ºC保存。
c. 冰上超声裂解细菌。超声功率200-300W，每次超声处理10s，每次间隔10s，共超声处理6次。
注：具体超声处理的方式须根据特定型号的超声仪器自行摸索和优化。
d. (可选做)如超声处理后裂解液非常粘稠，可以加入RNase A至10µg/ml及DNase I至5µg/ml，冰上放置10-15min。或者使用适当的装好了较细针头的注射器，反复抽吸数次以剪切粘稠的基因组DNA等。
e. 4ºC 10,000g离心20-30min，收集细菌裂解液上清并置于冰水浴或冰上。可以取20µl上清留作后续检测用。
注：上清必须保持澄清（即不含任何不溶物），才能进行下一步的纯化。上清中如混有不溶性杂质会严重影响后续纯化获得蛋白的纯度。
f. 取1ml混合均匀的Ni NTA Beads 6FF，4ºC离心(1000g×10s)弃去储存液，向凝胶中加入0.5ml Lysis buffer混匀以平衡凝胶，4ºC离心(1000g×10s)弃去液体，再重复重复平衡1-2次，弃去液体。将约4ml 细菌裂解液上清加入其中，4ºC在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动60min。
注：Ni NTA Beads 6FF也可不平衡直接使用，但蛋白的得率有可能会有5-20%的下降。
g. 将Lysis buffer和Ni NTA Beads 6FF的混合物装入试剂盒提供的亲和层析柱空柱管中。
注：也可先取1ml混合均匀的Ni NTA Beads 6FF装柱，再用0.5ml Lysis buffer平衡2-3次后加入约4ml细菌裂解液上清，后续可以将穿流液收集后重复上柱3-5次以充分结合目的蛋白。
先混合后装柱的方式操作起来相对麻烦，但更有利于带有His标签重组蛋白与镍柱的充分结合，特别是当His标签被蛋白本身部分遮挡或His标签重组蛋白浓度很低时与镍柱的结合效率会高一些。
h. 将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出，收集约20微升穿流液作后续分析用。
i. 洗柱5次，每次加入0.5-1ml washing buffer，每次均收集约20微升穿柱的洗涤液用于后续的分析检测用。洗柱及下一步洗脱过程中可以用Bradford法检测每次洗涤液和洗脱液中的蛋白含量，从而考虑增加或减少洗涤和洗脱的次数。
注：如果出现后续获得蛋白纯度不够高的情况，可以再增加洗柱次数2-3次。
j. 加入2-3ml除核酸试剂进行除核酸，重复一次。
k. 洗脱目的蛋白6-10次，每次用0.5ml elution buffer。将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中。收集获得的洗脱液即为纯化的His标签蛋白样品。
4. 简化的操作流程：
a. 细菌中的目的蛋白诱导表达后，离心沉淀细菌。
b. 每克细菌沉淀湿重加入4ml Lysis buffer，可添加适量蛋白酶抑制剂，充分重悬细菌。
c. 加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml并混匀，冰水浴或冰上放置30min。
注：溶菌酶可以用裂解液配制成100mg/ml的母液，临使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以适当分装后-20ºC保存。
d. 冰上超声裂解细菌，离心取上清。
e. Ni NTA 6FF装柱，1ml Lysis buffer平衡纯化柱2次。
f. 步骤4d中的上清上柱。
注：上清上柱时可以收集穿流液并重复上柱3-5次，以充分结合His标签蛋白。
g. 加入2-3ml（2倍柱体积）除核酸试剂进行除核酸，重复一次。
h. 用0.5ml washing buffer洗柱5次。
注：如果出现咪唑浓度偏低的情况，可以自行添加适量咪唑，如果出现咪唑浓度偏高的情况，可以使用试剂盒提供的Lysis buffer作为洗涤液使用。
i. 用0.5ml elution buffer洗脱6-10次。
说明书下载常见问题一：没有收集到目标蛋白
在蛋白纯化过程中，使用洗脱液对填料上的目标蛋白进行洗脱，在收集液中没有检测到目标蛋白。
问题自查 1:蛋白表达情况怎么样？ 目标蛋白是否有正常表达？标签是否正常表达且没有被折叠覆盖？
（1）蛋白样品在用填料纯化之前，先跑下 SDS-PAGE 胶并用考马斯亮蓝染色，如果能看到比较清晰且较粗的目标蛋白条带 ，则表达量较高；
（2）蛋白样品跑 WB，用标签抗体检测，如果能检测到目标条带，则标签有正常表达；
（3）检测蛋白样品中的蛋白浓度，并结合 SDS-PAGE 显示的目标蛋白的占比，可以估算出目标蛋白的表达量;
（4）或者也可以考虑在目标蛋白同时加上 GFP 等荧光标记，通过荧光检测得到蛋白表达量；
（5）如果蛋白上清液中没有检测到蛋白 ，且在沉淀中有大量蛋白 ，此时可能是蛋白形成了包涵体
优化方案：如果蛋白表达量不高，需要对前期质粒构建和蛋白表达过程进行优化。例如更换表达载体，更换标签，进行密码子优化，筛选大肠杆菌培养温度和时间，筛选诱导剂（如IPTG）浓度 ，诱导温度和时间等；
问题自查 2： 目标蛋白到哪里去了？ 是没有结合在柱子上 ，还是在柱子上没有洗脱下来？
同时收集上样和洗杂时的流穿液以及洗脱目标蛋白时的洗脱液，如果流穿液中有大量的目标蛋白 ，则表示目标蛋白没有和填料有效结合；如果流穿液和洗脱液中都没有目标蛋白，则表示目标蛋白可能还结合在柱子上 ，没有洗脱下来；
实验优化一：流穿液中有目标蛋白
His 标签
①样品或结合缓冲液条件不合适 ：样品和结合缓冲液中不能含有高浓度的金属螯合剂（例如 EDTA） ，高浓度强还原剂（例如 DTT） ，或者高浓度的咪唑；
②His 标签和填料结合较弱：适当降低上样流速并增加孵育时间；增加 His 标签的数量（6-10 个）；
③调整结合缓冲液的 PH 为 7-8 ， PH 过低会影响蛋白结合；上样量超出填料载量：使用更大体积的层析柱；
实验优化二： 目标蛋白没有洗脱下来：
His 标签
①洗脱条件过于温和 ：适当增加洗脱缓冲液中的咪唑浓度 ，或者尝试降低洗脱液的 PH；增加洗脱步骤和时间；
②目标蛋白与填料发生非特异性结合 ：在洗脱缓冲液中加入非离子型去垢剂（例如2% Triton X-100） ，或者增加洗脱液中 NaCl 的浓度
③目标蛋白在填料上发生了沉淀 ：减少上样量 ，添加去垢剂或者在变性条件下进行洗脱；
常见问题二：蛋白纯度不高 ，杂带较多
问题描述：收集液中有目标蛋白，但同时也有很多杂蛋白。这种情况一般发生在使用His 标签时， 以下主要对 His 标签蛋白纯化进行讲解。
问题自查 1 是否目标蛋白本身表达不高 ，而杂蛋白表达较高
实验优化 1：按照问题 1 中的方法检测目标蛋白表达；优化质粒构建和蛋白表达的步骤；
问题自查 2 蛋白是否容易降解？
在 SDS-PAGE 胶上观察杂带的分子量；如果杂带的分子量比目标蛋白分子量小，且相差值约为几个结构域或特定酶切位点，说明可能该杂带是由目标蛋白降解产生的。
优化方案：
（1）使用线性洗脱的方式： 500 mM 咪唑 ，0%-100%线性梯度洗脱 10 CV；
（2）漂洗缓冲液中加入少量咪唑；
（3）裂解液和缓冲液中添加去垢剂（2% Triton X-100/Tween 20）；或添加甘油（20%以内） ；增加缓冲液中 NaCl 浓度至 500 mM
（4）其他考虑方向包括 His 标签蛋白被部分降解 ，优化结合和洗脱条件 ，尝试不同金属离子螯合的填料，构建双标签蛋白，添加去垢剂，还原剂等添加剂破坏杂质和目的蛋白间
的相互作用等等
（5）在镍柱纯化之后增加离子交换和分子筛等步骤继续纯化；
常见问题三：填料变色
（1）镍柱变白 ：如果上样量较大 ，镍柱填料可能由于结合了大量的蛋白而呈现发白的现象 ，这是正常的；
但如果缓冲液中存在螯合剂如 EDTA 等 ，可能导致镍离子从柱上脱落而发白 ，并且导致目的蛋白的结合量降低；
（2）镍柱出现棕色 ：这主要是缓冲液中还原剂的影响。在常规的填料中存在的游离镍离子 ，可能会被 DTT 还原生成棕色的沉淀。
（3）杂质与目的蛋白有相互作用 ：加入去垢剂、还原剂、甘油等破坏杂蛋白与目的蛋白之间的相互作用 ，或者尝试调整缓冲液的盐浓度。
常见问题四：柱子堵了
问题描述：柱子发生堵塞，流速降低，压力增高；此时需要根据说明书对层析柱进行清洗。
问题自查 1 样品和缓冲液上样前有没有过滤？
实验优化 1 ：收集到蛋白样品之后，建议先用超声破碎，然后离心取上清，然后使用0.45um 或者 0.2um 的滤膜进行过滤；
问题自查 2 是否样品浓度或者粘性过高？
实验优化 2 ：可以适当稀释样品；如果样品粘性比较高，也可能是样品中含有高浓度的宿主核酸，可以增加超声时间，或者加入核酸酶（5 ug/ml DNase1, 1 mM Mg2+）进行处理。
问题自查 3 层析柱有没有定期清洗？
实验优化 3 ：层析柱在使用 5-10 次之后，建议对层析柱进行清洗。清洗方法可以参考说明
常见问题五:填料应该如何清洁再生？
His 标签
常规清洗：可使用 5-10 倍柱体积的纯水或者漂洗缓冲溶液对柱子进行清洗。
当填料在使用过程中发现反压过高或者填料上出现明显污染，需要进行在位清洗（CIP）操作。
N30210/N30230 填料在位清洗前需先去除镍离子，（不脱镍直接上碱洗可能会产生棕色沉淀导致柱子堵塞） ；为了避免不同样品间的相互干扰，或者当介质污染比较严重时(反压增加) ，需要对介质进行在位清洗。在位清洗前，需要预先除去介质上螯合的金属离子(见再生操作) 。在位清洗时，可采用反向冲洗的方法。
1)对于以离子键结合的蛋白，可用 2~3CV 以上的 2M NaCl 清洗，
2)对沉淀蛋白、以疏水性结合的蛋白或脂蛋白，可用 1MNaOH 清洗(1~2h)，并用 3~10CV平衡液和 3 CV 以上的纯水冲洗。
3)对疏水性结合的蛋白、脂蛋白和脂类物质，可用 5~10CV 的 70%乙醇或 30%异丙醇清洗(20min 以上) ，并用 3~10CV 的纯水冲洗。
此外，也可用2CV 含去污剂的碱性或酸性溶液清洗。如用 0.1~0.5%的非离子去污剂+0. 1M乙酸冲洗 1~2h ，并用 5~10CV 的 70%乙醇冲洗去除去污剂，然后用 3~10CV 的纯水冲洗。
N30250 填料可直接进行在位清洗
当填料在使用过程中发现反压过高或者填料上出现明显污染，需要进行在位清洗操作。
1) 去除强疏水性结合的蛋白、脂蛋白和脂类
方法一:使用 30%异丙醇清洗 5~10CV ，接触时间为 15~20min 可以去除此类污染物，再用10CV 的纯水清洗;
方法二:使用 0.3M 或 0.5M NaOH 溶液冲洗填料 3CV ，然后用 10-15CV 的纯水清洗。
2)去除离子作用结合的蛋白
使用 1.5M NaCI 溶液清洗 10~ 15min ，再用 10CV 纯水清洗，清洗好
的柱子用 2CV 的 20%乙醇冲洗，置于 2~8°C 保存。
常见问题六：摇菌 250ml ，用填料纯化最少需要几毫升？
常规来说 250ml 菌液可以摇出 1g 左右菌泥，重悬破碎体积为 10ml 左右，大约用 0.5-1ml左右的填料就够了，填料载量是 XX mg/ml 左右。
也和客户的蛋白表达量有很大关系，如果客户的蛋白表达量明显偏低或偏高的话，填料量是需要对应减少或增加的。客户可以破碎后先跑个电泳看下大致表达情况。
常见问题七：标签蛋白纯化试剂盒的缓冲液组分是什么？
H1032/H1035 试剂盒配方
裂解液：ripa 中
结合缓冲液：ripa 中（50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate， 0.1% SDS 等）
漂洗缓冲液：20mM 咪唑，0.3M NaCl ，50mM Tris pH7.9
洗脱缓冲液：500mM 咪唑，0.5M NaCl ，50mM Tris pH7.9
常见问题八：标签该如何选择
标签的选择主要是根据蛋白的特点以及对纯度的要求，新手建议可以从 His 标签开始做起。
①His 标签标签小，纯化步骤简便，纯化条件温和，能纯化可溶性/包涵体蛋白，一般不会影响蛋白的功能结构，且可以产出大量的目标蛋白，纯度和其他标签相比略低，如果对纯度不是要求特别高的情况下首选；
②GST 标签洗脱条件温和，有助于保持蛋白功能活性，适合 pull-down 检测，具有很好的线性动态范围，但分子量较大，需要在纯化后去除标签，且不适宜变性环境；
③MBP 标签可以减少目标蛋白的降解，增加蛋白的表达量和稳定性，提高表达产物的水溶性，但标签较大，对蛋白的结构和功能可能会有一定影响；
④Strep 标签能纯化出高纯度的目标蛋白，纯化条件温和，能进行变性条件下的纯化。纯化柱和填料的价格和其他标签相比略高；
